八味龙钻颗粒HPLC 指纹图谱建立及7 种成分测定

陆敏灵， 覃洁萍∗， 罗宇东， 谭红声， 梁梓敏， 郭海姣

（1.广西中医药大学药学院，广西 南宁530001；2.广西中医药大学制药厂，广西 南宁530023）

类风湿关节炎是一种严重危害人类健康的常见病、多发病，目前国内外尚无特效药物。八味龙钻颗粒是广西中医药大学壮医药专家庞宇舟教授在挖掘总结壮医药治疗类风湿关节炎传统药物的基础上结合“壮医毒论” 内涵［1］，按照壮医理论配伍临床验方研发的壮成药，主要由飞龙掌血、大钻、两面针、青风藤、鸡血藤、九龙藤、八角枫、五指毛桃8 味药材组成，具有抗炎、镇痛、抗风湿、免疫抑制之功效，治疗类风湿关节炎疗效显著，方中九龙藤、鸡血藤等常用于治疗风湿性免疫病［2］，其中前者具有较强的镇痛抗炎活性，是壮医风湿免疫病专科常用药［3］，而后者具有活血补血、通络、祛风除湿功效；青风藤祛风散瘀，利湿止痛；五指毛桃健脾益气，化湿舒筋，行气止痛［4］；飞龙掌血生物总碱、乙醇提取物、水提物均有镇痛抗炎作用［5-6］，在民间主要用于治疗风湿疼痛、胃痛、跌打损伤、吐血、刀伤出血、经闭、痛经等症［7］；两面针具有消肿止痛作用［8-10］；大钻（大血藤） 中红景天苷有抗疲劳、抗炎、抗衰老、免疫调节等多种药理作用，是其活性成分之一［11］；青藤碱具有抗炎［12］、镇痛、抗风湿［13］等药理作用；补骨脂素常被用作五指毛桃质量控制指标［14-16］；橙皮苷具有抗炎、调节免疫等药理活性［17］；氯化两面针碱在抗炎方面作用显著［18］；没食子酸、原儿茶酸均具有明显抗氧化、抑制血小板聚集作用［19］；儿茶素具有一定促进造血细胞增殖作用，是鸡血藤补血活血的主要物质基础［20］；没食子酸具有抗菌、抗氧化及抗肿瘤的药理作用［21-22］。

本实验在课题组前期测定氯化两面针碱、橙皮苷、补骨脂素含有量的基础上，建立该制剂HPLC指纹图谱，并测定没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷、补骨脂素的含有量，以期更全面系统地评价其质量，确保临床应用安全有效。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色谱仪，配置紫外检测器；KQ5200 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TGL-16G 离心机（上海安亭科学仪器厂）；SQP 电子天平［十万分之一，赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司］。

没食子酸（110831-201605，含有量90.8%）、原儿茶酸（110809-201205，含有量99.9%）、青藤碱（110774-200507， 含有量99.1%）、 红景天苷（110818-2015007， 含 有 量 99.4%）、 儿 茶 素（110877-201604， 含 有 量 99.2%）、 橙 皮 苷（110721-201617， 含 有 量 96.7%）、 补 骨 脂 素（110739-201617，含有量99.1%） 对照品均购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯 （美国Fisher 公司）；甲醇、磷酸为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）； 超纯水由密思博超纯水机制备。

10 批八味龙钻颗粒（10 g／袋，每袋相当于原药材35 g，批号20170501、20170502、20170503、20170701、 20170702、 20170703、 20170704、20170705、20170706、20170707），均由广西中医药大学制药厂提供。八角枫、大钻、飞龙掌血、鸡血藤、两面针、九龙藤、五指毛桃、青风藤均购自广西玉林市祥生中药饮片有限责任公司，经广西中医药大学制药厂质量保证部罗宇东副主任药师鉴定为正品，均符合 《广西瑶药材质量标准》 相关要求。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Phenomenex Gemini C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈 （A） -0.1%磷酸 （B）， 梯度洗脱 （0 ～10 min，6%A；10～20 min， 12%A； 20 ～30 min， 19%A； 30 ～40 min，27%A；40 ～50 min，35%A；50 ～60 min，45%A）；检测波长270 nm（0 ～50 min）、245 nm（50 ～60 min）；柱温30 ℃；体积流量1 mL／min；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷、补骨脂素对照品适量，甲醇分别制成1.357 8、0.960 0、0.740 0、0.901 0、1.014 2、0.126 0、0.945 0 mg／mL贮备液，取适量置于同一量瓶中，甲醇分别制成0.069 6、0.008 7、0.204 6、0.256 4、0.100 4、0.024 3、0.007 1 mg／mL 溶液，即得，置于冰箱中贮存。

2.2.2 供试品溶液 精密称取颗粒3 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入50 mL 70%甲醇，称定质量，超声 （200 W、40 kHz） 20 min， 冷却至室温，70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，续滤液离心，取上清液，即得。

2.3 HPLC 指纹图谱建立

2.3.1 稳定性试验 取颗粒（批号20170501） 适量，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，以6 号峰（青藤碱） 保留时间和色谱峰峰面积为参照，测得其余11 个共有峰相对保留时间RSD 为0.33%～1.8%，相对峰面积RSD 为0.88%～1.7%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.2 精密度试验 取颗粒（批号20170501） 适量，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，以6 号峰（青藤碱） 保留时间和色谱峰峰面积为参照，测得其余11 个共有峰相对保留时间RSD 为0.40%～1.6%，相对峰面积RSD 为0.62%～1.8%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 精密称取同一批颗粒（批号20170501）6 份，每份约3 g，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，以6 号峰（青藤碱） 保留时间和色谱峰峰面积为参照，测得其余11 个共有峰相对保留时间RSD 为0.18%～1.2%，相对峰面积RSD 为0.33%～1.8%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 建立方法 取10 批颗粒，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，见图1，再建立HPLC 指纹图谱的共有模式图谱（平均值），通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统” 进行分析，见图2。在对照图谱上共生成12 个共有峰，其中对照图谱中6 号色谱峰（青藤碱） 分离度较好，色谱响应值较高，保留时间居中，故选择其作为参照峰。指纹图谱相似度评价采用 “中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723 版） ”，结果见表1，可知相似度均在0.989 以上，指标性成分一致性较好。

表1 10 批样品相似度Tab.1 Similarities of ten batches of samples

图1 10 批样品HPLC 指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints of ten batches of samples

图2 各成分HPLC 色谱图（Ⅰ）Fig.2 HPLC chromatogram of various constituents（Ⅰ）

2.3.5 主要共有峰归属分析 精密吸取各对照品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，同时记录色谱图和各色谱峰紫外吸收光谱，并与指纹图谱共有模式中的各主要共有峰进行对比。结果，3、5、6、7、9、10、12 号峰分别为没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷、补骨脂素。

2.4 7 种成分含有量测定

2.4.1 系统适用性试验 取对照品、供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图3。由图可知，各成分色谱峰分离度良好，拖尾因子均在0.95～1.05 之间，其他成分无干扰，理论塔板数以青藤碱计为33 000。

图3 各成分HPLC 色谱图（Ⅱ）Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents（Ⅱ）

2.4.2 线性关系考察 取“2.2.1” 项下对照品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样4、6、8、10、12、14 μL 测定。以峰面积为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X） 进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.4.3 精密度试验 取“2.2.1” 项下对照品溶液，在“2.1” 色谱条件下进样测定6 次，测得没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷、 补骨脂素峰面积RSD 分别为1.3%、1.3%、 0.77%、 0.87%、 1.1%、 0.94%、 1.2%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 取颗粒（批号20170501） 适量，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷、补骨脂素峰面积RSD 分别为1.2%、 1.1%、 1.4%、 1.8%、 1.0%、 1.0%、1.2%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4.5 重复性试验 精密称取颗粒 （批号20170501）6 份，每份3.0 g，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷、补骨脂素峰含有量RSD 分别为0.76%、1.9%、2.0%、1.5%、2.0%、1.5%、1.5%，表明该方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验 精密称取颗粒（批号20170501） 约1.5 g（没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷、补骨脂素含有量分别 为0.695 9、 0.136 4、 3.562 0、 3.699 1、1.213 6、0.323 4、0.076 5 mg／g），共6 份，分别精密加入没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷及补骨脂素对照品1.050 0、0.205 0、5.500 0、5.600 0、1.820 0、0.480 0、0.120 0 mg，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，各成分平均加样回收率分别为103.6%、102.1%、102.5%、99.6%、103.2%、99.2%、98.5%，RSD 分 别 为1.1%、 1.0%、 1.4%、 1.7%、 1.4%、0.92%、1.3%。

2.4.7 样品含有量测定 精密称取10 批颗粒各2份，每份约3 g，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算含有量，结果见表3。

表3 各成分含有量测定结果（mg／g，n=2）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg／g，n=2）

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法选择 本实验以甲醇、乙醇、水、1%盐酸、85%甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇为提取溶剂，比较了超声、回流提取，以及提取时间、溶剂用量、提取次数等因素对各成分含有量的影响。结果，3 g 样品加50 mL 70%甲醇超声20 min 时，没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷、补骨脂素含有量最高，而且操作简便，故选择其作为供试品溶液制备方法。

3.2 检测波长选择 本实验采用二极管阵列检测器进行检测，比较各成分在不同波长下的色谱图，发现各成分最大吸收波长有明显差异，虽然大多在270 nm 处均有较高的灵敏度和较好的峰形，但补骨脂素峰形不理想，故选择多波长检测。最终确定，没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷在270 nm 波长处检测，而补骨脂素在其最大吸收波长245 nm 处检测，此时各成分响应值高，色谱峰峰形和分离度良好。

3.3 专属性分析 八味龙钻颗粒HPLC 指纹图谱中标定了12 个共有峰，并指认出其中7 个。虽然10 批样品是由不同产地、批次药材制得，各成分含有量可能存在一定差异，但其相似度较好，均在0.989 以上，表明指纹图谱相对稳定，不同批次样品中指标性成分的一致性较好。

4 结论

本实验建立八味龙钻颗粒HPLC 指纹图谱，并测定其中没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷、补骨脂素的含有量，可同时用于该制剂主要成分的定性、定量分析，而且该方法简便快速，准确可靠，稳定性好，可为其质量控制与评价提供更有效的检测手段。