补肺化纤饮对肺纤维化小鼠肺组织TGF-β1和PDGF表达的影响

唐明文 贾 丹 余 燕 刘 玉 张小瑾 叶小丹 陈 生

特发性肺纤维化(Idiopathicpulmonaryfibrosis IPF)是一种原因不明、病死率高、以弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱最终导致肺间质纤维化为特征的疾病。研究表明，肺泡损伤修复中抗纤维化和致肺纤维化之间的平衡紊乱是IPF的主要发病机制[1]。各种生长因子在肺纤维化的发病机制中发挥着重要作用，尤其是TGF-β被认为是关键的致纤维化因子[2]，也是迄今为止发现的最强的细胞外基质沉积促进剂。血小板源性生长因子(PDGF)也在肺纤维化的行程中发挥着重要作用。TGF-β1与PDGF二者之间呈正相关的关系，共同促进肺纤维化的发生、进展。因此探讨与研究影响TGF-β1与PDGF表达的抗肺纤维化药可作为目前治疗肺纤维化的一个突破口。2018年11月至2019年1月通过实验观察补肺化纤饮对肺纤维化大鼠TGF-β1与PDGF表达的影响，现报道实验结果如下。

1.实验动物及材料

37只6～7周龄KM雄鼠购自广东省医学实验动物中心；博莱霉素(上海生工；A606211)；甲强龙(主要成分甲泼尼龙琥珀酸钠；Pfizer Manufacturing Belgium NV；注册证号H20170197)；TGF-β1抗体(GTX45121)；PDGFB抗体(ab21234)；补肺化纤饮药剂由深圳市中医院呼吸科提供(原药125g熬制成150ml药剂)。

2.实验分组

A组：基础对照组6只(A1～A6)。

B组：模型组6只(B1～B6)。

C组：甲强龙治疗组7只(C1～C7)。

D组：低剂量补肺化纤饮治疗组9只(D1～D9)。

E组：高剂量补肺化纤饮治疗组9只(E1～E9)。

3.实验处理

3.1 小鼠肺纤维化动物模型制作 造模前每只KM雄鼠称重，以水合氯醛行麻醉手术，经气管插管后向肺部雾化喷入终浓度为8mg/kg的博来霉素进行化学诱导形成肺纤维化，10天后行第二次博来霉素喷雾诱导连续造模。

3.2 第二次给博莱霉素后第二天开始给药 按照实验分组，A组和B组每天灌胃生理盐水1ml；C组每天灌胃1mg/kg甲强龙；D组每天灌胃10g/kg补肺化纤饮；E组每天灌胃20g/kg补肺化纤饮，各组均给药10天。给药结束后第2天处死实验动物，取肺组织用生理盐水清理残留血液后置于4%多聚甲醛溶液中浸泡固定，并包埋切片。

4.检测指标和方法

4.1 肺组织切片行Masson染色

4.2 肺组织切片进行TGF-β1和PDGFB免疫组化检测 免疫组化染色的半定量判定：A染色强度：无色、淡黄、棕黄、棕褐分别计为0分、1分、2分、3分；B染色广度：阳性细胞数占总细胞数的百分比。

5.实验结果

5.1 Masson染色结果 见图1。

注：A组：基础对照组，B组：模型组 ，C组：甲强龙治疗组，D组：低剂量补肺化纤饮治疗组，E组：高剂量补肺化纤饮治疗组。图1 Masson染色结果

5.2 TGF-β1和PDGFB免疫组化检测结果 见图2，图3。

注：A组：基础对照组，B组：模型组 ，C组：甲强龙治疗组，D组：低剂量补肺化纤饮治疗组，E组：高剂量补肺化纤饮治疗组。图2 TGF-β1免疫组化检测结果

注：A组：基础对照组，B组：模型组 ，C组：甲强龙治疗组，D组：低剂量补肺化纤饮治疗组，E组：高剂量补肺化纤饮治疗组。图3 PDGFB免疫组化检测结果

5.3 各组小鼠肺组织TGF-β1和PDGFB蛋白的表达水平 见表1。

表1 各组小鼠肺组织TGF-β1和PDGFB蛋白的表达水平

6.实验结果

低剂量和高剂量治疗组分别对比模型组肺组织TGF-β1和PDGFB蛋白的表达水平均明显减低，两组之间差异均有统计学意义(P<0.05)，提示补肺化纤饮可抑制转化生长因子-β的胶原合成，减少肺细胞外基质产生，阻断血小板衍生因子的丝分裂，从而抑制肺纤维化进程。

7.讨论

肺纤维化属于纤维增殖性疾病的范畴,其病变主要累及肺间质,也可累及肺泡上皮细胞及肺血管,以肺成纤维细胞的异常增生和胶原蛋白为主的细胞外基质过度沉积为主要表现,病程一般呈进行性发展，最终导致呼吸功能衰竭而死亡[3]。随着污染、环境恶化等因素，肺纤维化已成为当今严峻的健康问题，但长期以来无药可医。2014年10月,美国FDA批准吡非尼酮和尼达尼布用于特发性肺纤维化的治疗[4],也只能延缓肺纤维化发展的进程。因西医治疗手段有限，中药及天然植物中提取有效单体成分已成为纤维化疾病治疗的新途径。中医药古籍中并无“肺纤维化”一词,根据其临床症状,中医常将其归为“肺痹”或“肺痿”,且多认为“肺痹”为肺纤维化的中早期阶段,“肺痿”为中晚期阶段[5]。在“龙江医派”学术思想指导下，我课题组历经20余年,对肺纤维化进行了大量的临床、实验研究，并与广州呼吸病研究所建立重大疾病(肺纤维化)合作攻关研究，认为其病机为“肺虚痰瘀”，或因外邪侵袭，或因情志内伤、病久体亏，肺气亏虚，气虚则血行无力，瘀血内生；子病及母，肺虚及脾，脾虚运化失司，水湿不运，痰浊内生，就则痰瘀互结，脉络瘀阻；最终导致肺气虚→痰瘀阻络→肺气愈虚→痰瘀阻络愈甚的恶性循环局面。治疗上则以“补肺化瘀涤痰”为法，拟定补肺化纤饮为主方。经过实验室研究，中药复方补肺化纤饮对肺纤维化大鼠TGF-β1、PDGF表达影响十分明显，为临床进一步研究提供安全有效的抗肺纤维化的中药复方制剂，进而为IPF的治疗提供良好的理论和实验基础。