重症肌无力患者血清miRNAs的表达及临床意义

杨 鸣 杨文臣 张淑峰 陈烨华

重症肌无力(MG)是一种神经肌肉接头传导障碍所致的获得性自身免疫性疾病，主要有乙酰胆碱受体、抗体、免疫细胞、补体等参与其过程[1～3]。重症肌无力患者主要出现骨骼肌无力、易疲劳，活动后加重、休息后缓解，晨轻暮重等临床表现，主要累及患者的眼外肌、延髓肌群和全身骨骼肌，严重影响患者的生活质量和生命安全[4]。据统计，我国每年重症肌无力的患病人数约为8～10万例，且呈逐年增加趋势[5]。目前，临床治疗重症肌无力主要采用胆碱酯酶抑制剂、免疫抑制剂、肾上腺皮质激素、免疫球蛋白、血浆置换及胸腺切除等方法，但这些措施不能有效控制该疾病的进展[6]。因此，寻找和开发治疗重症肌无力的新型药物和新思路具有重大的临床意义。本文探讨重症肌无力患者血清miRNAs的表达情况，为重症肌无力的诊断及治疗提供依据。

1.资料与方法

1.1 一般资料 参照重症肌无力的诊断标准[7]，选取在2017年12月至2018年8月期间我院收治的60例重症肌无力患者作为研究对象。其中，男性32例，女性28例，年龄范围60～80岁，平均年龄(65.8±10.8)岁。并选取同期在我院接受体检的60例健康志愿者为对照组。其中，男性30例，女性30例，年龄范围为60～80岁，平均年龄(66.0±11.1)岁。比较两组患者的性别、年龄等一般资料，差异无统计学意义(P>0.05)，可进行后续比较。本研究纳入标准：患者均符合诊断标准者；与本院签署知情同意书者。排除标准：严重器官功能不全者；严重感染者；恶性肿瘤者；自身免疫性疾病者；药物禁忌证者；难以控制的糖尿病、高血压者；肺结核者。本研究经我院医学伦理委员会批准，患者均签署书面知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 收集血清样本：研究人员使用EDTA抗凝管，清晨采集重症肌无力患者及健康志愿者空腹静脉血6ml，并立即使用高速离心机(Thermo，美国)，转速为12000rpm/min室温离心5min。将上清液，即血清，转移至另一无RNA酶的EP管中，储存于-80℃冰箱(Thermo，美国)。

1.2.2 提RNA、逆转录及实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)：收集血清，参照血清miRNA提取试剂盒(Foregene，中国)说明书，分离提取血清miRNA。使用10×RT-Buffer 1μl；Random Primers 1μl；dNTPs 0.4μl；RNase 0.5μl；总RNA 0.5μg将RNA逆转录成cDNAs。并应用SYBR Green 10μl、ddH2O 7μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板cDNA 1μl，以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因的表达，其中U6作为内参基因。所有引物均购自上海吉玛基因公司。本实验中所有引物序列见表1。

图1 重症肌无力患者血清中miRNAs的表达情况

引物序列(5 至3 )microRNA-107F:CGCCGCAGCAGCATTGTACAGR:GTGCAGGGTCCGAGGTmicroRNA-25F:ATCCAGTGCGTGTCGTGR:TGCTCATTGCACTTGTCTCmicroRNA-20bF:ATGCCAAAGTGCTCATAGTGR:GTGCAGGGTCCGAGGTmicroRNA-451F:ACACTCCAGCTGGGAAACCGTTACCATTACTR:CTGGTGTCGTGGAGTCGGCAAmicroRNA-29bF:GCTAGCTTATCAGACTGATGTTGAR:GTAGCACCATTTGAAATCAGTGTTmicroRNA-27aF:ACAGGCTAGCGCCGCCTAACR:CCTTAAGGCCCAAGATTACGU6F:TCGCTTCGGCAGCACATATACR:TATGGAACGCTTCACGAATTT

1.3 统计学方法 采用Graphpad统计软件进行统计分析，计量数据以均数±标准差表示，两组比较采用配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 健康对照组和重症肌无力组呼吸功能指标的比较 分析健康对照组(n=60)和重症肌无力组(n=60)的呼吸肌耐力、肺活量、最大通气量、肌无力水平评分等四项指标，进行比较分析。结果显示，重症肌无力组呼吸肌耐力、肺活量、最大通气量低于对照组，而重症肌无力组肌无力水平评分高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表2。

表2 两组患者呼吸功能指标的比较

2.2 miRNAs在重症肌无力患者血清中的表达 收集健康对照组(n=60)和重症肌无力组(n=60)血清，提取血清miRNA，并进行qRT-PCR实验检测6种与骨发育相关miRNAs的相对表达水平。结果显示，与健康志愿者相比，miR-107、miR-25、miR-20b在重症肌无力患者血清中表达降低，其中miR-107表达降低最显著(图1A至1C)。而miR-451、miR-29b和miR-27a在重症肌无力患者血清中表达升高，其中miR-29b表达升高最显著(图1D至1F)。

图2 重症肌无力患者接受治疗前后血清中miRNAs的表达情况

2.3 miRNAs在重症肌无力患者接受治疗前后血清中的表达 收集重症肌无力患者接受治疗前后血清样本，提取血清miRNA，并进行qRT-PCR实验检测miR-107、miR-25、miR-20b、miR-451、miR-29b和miR-27a的相对表达水平。结果如图2A至2C显示，与治疗前相比，miR-107、miR-25、miR-20b在重症肌无力患者治疗后血清中表达呈升高趋势(图2A至2C)。而与治疗前相比，miR-451和miR-27a在重症肌无力患者接受治疗后血清中表达无差异，miR-29b表达显著降低(图2D至2F)。

3.讨论

microRNAs(miRNAs)是一类长度约为22个核苷酸的非编码蛋白的小分子RNA[8,9]。通过结合靶mRNA的3’非编码端(3’-untranslated region，UTR)，降解或其靶mRNA翻译，负性调控其靶基因的表达，进而参与细胞增殖、衰老、凋亡、分化及疾病的发生发展过程[10,11]。近年来，有研究报道miRNAs可参与重症肌无力的发生[12,13]，但相关研究较少，且尚未有研究报道miRNAs在重症肌无力患者血清中表达情况。因此，本文探讨重症肌无力患者和自身免疫性重症肌无力大鼠血清miRNAs的表达情况，为重症肌无力的早期诊断及治疗提供依据。

本研究中，我们分析健康对照组(n=60)和重症肌无力组(n=60)的呼吸肌耐力、肺活量、最大通气量、肌无力水平评分等四项指标，进行比较分析。结果显示，重症肌无力组呼吸肌耐力、肺活量、最大通气量低于对照组，而重症肌无力组肌无力水平评分高于对照组。此外，我们发现与健康志愿者相比，miR-107、miR-25、miR-20b在重症肌无力患者血清中表达降低，而miR-451、miR-29b和miR-27a表达升高；与治疗前相比，miR-107、miR-25、miR-20b在重症肌无力患者治疗后血清中表达呈升高趋势，miR-451和miR-27a无差异，miR--29b表达显著降低。

综上所述，miR-107和miR-29b可能参与重症肌无力的发生和发展过程，这四种miRNAs可以作为早期诊断及治疗重症肌无力的新靶点。