金柑CHS和CHI基因的克隆及表达分析

马小迪，谭嫣，王久照，刘小刚，曾明*

(1.西南大学 园艺园林学院，重庆 400715； 2.南方山地园艺学教育部重点实验室，重庆 400715)

金柑(FortunellacrassifoliaSwingle.)，芸香科金柑属植物。金柑植株发育童期短，当年抽生枝条即可开花结果，具有一年多次开花结果的特性；金柑果实颜色金黄，在春节前后成熟，寓意吉祥喜庆；味道甘甜可口，作为少见的带皮食用型柑橘类中国特色水果，风味独特，其营养与医药保健功能受到广泛关注。

类黄酮(flavonoids)是重要的一类多功能性次生代谢产物，在植物中具有抗病原菌、抗UV、抗盐、抗旱等作用，也是一种对人体有益的营养物质。已有报道对葡萄[1]、梨[2]、草莓[3]等类黄酮的合成进行了研究。金柑虽为柑橘近缘属植物，但在类黄酮组成含量上具有差异性。柑橘以黄烷酮和黄酮为主[4-5]，主要存在于血橙中的花青苷和柠檬中的黄酮醇[6]等，而金柑含有丰富的二氢查尔酮和根皮素-3′,5′-二碳葡萄糖苷[7-8]，是研究类黄酮合成的一种特色材料。

目前，对金柑的研究主要集中在栽培管理与保鲜技术、活性物质的含量检测与提取利用等方面，对抗逆基因和开花基因仅进行了初步研究。徐志龙等[9]研究了不同砧木对阳朔金柑树体和果实品质的影响；周翡云等[10]对融安金柑结果母枝质量与果实品质进行了相关性分析；Kondo等[11]研究了环境因子对金柑抗氧化活性的影响；Barreca等[12]对金柑类黄酮的抗氧化性能进行了测定；龚小庆[13]以金柑为材料，克隆了3个抗逆基因，并且鉴定解析了基因的功能及其作用机制；胡颖[14]对融安金柑花器官发育转录特征进行了分析，并研究了相关基因的功能；张奕[15]克隆了融安金柑开花关键基因，并对其功能进行了初步分析。

类黄酮通过苯丙烷途径(phenylpropanoid pathways)进行生物合成，是次生代谢研究的主要方向。查尔酮合成酶(chalcone synthase，CHS)和查尔酮异构酶(chalcone isomerase，CHI)是类黄酮合成过程中的关键酶。查尔酮合成酶催化3分子丙二酰-CoA和1分子对香豆酰-CoA缩合形成查尔酮，是类黄酮合成的重要限速步骤[16-17]。查尔酮异构酶催化柚皮苷查尔酮异构化，形成生物活性二羟基黄烷酮，该酶是第1个被认识的黄酮类化合物合成相关酶。CHS和CHI基因已从很多植物中被克隆且进行了功能鉴定，如金鱼草、碧冬茄、玉米、圆叶牵牛、非洲菊、拟南芥和小立碗藓[18-26]。

近年来，生物活性物质相关基因的表达研究已成为果实品质研究的一个热点，但对金柑类黄酮合成相关基因的克隆与表达研究还未见报道。本研究从金柑中分离CHS和CHI编码基因，通过qRT-PCR(quantitative real time polymerase chain reaction)定量分析它们在果实成熟过程中的表达模式，进一步分析基因表达与类黄酮积累的相关性，探索类黄酮生物合成途径中关键基因的遗传调控机制，以期为金柑类黄酮的合成机理研究提供基础信息，对调控柑橘次生代谢产物合成、提高类黄酮产量提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料

实验材料为不同发育阶段的浏阳金柑果实，采集于中国农业科学院柑橘研究所国家果树种质重庆柑橘圃，树龄约10年。于花后15、31、69、99、130及156 d采集果实样品，其中花后15和31 d的果实，由于果皮和果肉不能有效分离，所以将果实作为整体进行分析，而其他时期果实的果皮和果肉分别进行分析。样品采集后，置于-80 ℃备用。

1.2 类黄酮测定

称取烘干样品0.5 g于10 mL离心管，加入10 mL 70%乙醇，混匀，超声破碎30 min(功率60%，水温45 ℃)，滤液浓缩除去有机溶剂，用4 mL蒸馏水定容备用。取适当稀释的1 mL待测液转移至10 mL容量瓶中，加入0.3 mL 5% NaNO2，摇匀；静置10 min后加入0.3 mL 10% AlCl3，摇匀；放置10 min后再加入2 mL 4% NaOH，摇匀；最后用60%乙醇定容至10 mL，15 min后于510 nm测定吸光值。以芦丁作为标样制备标准曲线。

1.3 qRT-PCR定量分析

采用大连宝生物公司的MiniBEST Plant RNA Extraction Kit试剂盒提取果实总RNA，用天根公司FastQuant RT Super Mix试剂盒反转录合成cDNA，随后基于SYBR法对基因进行qRT-PCR验证。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)，内参基因为Actin。

表1 用于qRT-PCR分析的引物序列

2 结果与分析

2.1 基因克隆及其序列特征

使用以下流程，获取金柑CHS和CHI编码序列。第一步，以拟南芥CHS和CHI蛋白为Query序列，用BlastP工具检索甜橙和克莱门氏小柑橘的蛋白数据库。在克莱门氏小柑橘蛋白数据库中，发现了4个候选CHS和2个候选CHI，而在甜橙中界定了同样数量的CHS和CHI，随后从NCBI中获取相应的转录本序列。第二步，使用HISAT软件，以上述候选CHS和CHI转录本序列为模板，从实验室之前测序完成的金柑果实转录组中获取编码CHS和CHI的reads。第三步，使用Trinity软件将这些reads组装成完整的转录本序列；第四步，对于不完整的转录本，采用FPNI-PCR进行序列补齐。最终，在金柑中界定了3个候选CHS(FmCHS1～FmCHS3)和2个金柑CHI(FmCHI1和FmCHI2)。FmCHS1、FmCHS2和FmCHS3分别编码390个、391个和391个氨基酸残基多肽，预测分子量为42.61、42.66和42.73 ku，等电点为5.71、6.28和5.70。FmCHI1和FmCHI2，分别编码222和209个氨基酸残基多肽，预测分子量为23.99和23.20 ku，等电点为5.15和5.00。

2.2 基于进化树的功能预测

采用近邻相接法(Mega 6.0)，分别构建FmCHS和FmCHI氨基酸序列进化树(图1和图2)。基于进化聚类关系(图1)，FmCHS1和FmCHS2能与已知功能CHS紧密聚为一类，界定为CHS蛋白；而FmCHS3单独聚类，界定为CHS-like蛋白。

已有研究表明，CHI蛋白能够被分为4种类型。类型Ⅰ(Type Ⅰ)广泛存在于维管植物，而类型Ⅱ(Type Ⅱ)为豆科植物所特有[27]。这两类CHI蛋白都属于bona fide CHI，具有CHI酶催化活性，参与植物类黄酮合成。类型Ⅲ(Type Ⅲ)在拟南芥中被显示为脂肪酸束缚蛋白(fatty acid-binding proteins，FAPs)，而类型Ⅳ(Type Ⅳ)在拟南芥中与类型Ⅰ的CHI蛋白互作促进类黄酮合成。基于进化聚类关系(图2)，FmCHI1界定为类型Ⅰ CHI蛋白，而FmCHI2界定为类型Ⅳ CHI蛋白。

图1 基于CHS基因的编码蛋白构建进化树

图2 基于CHI基因的编码蛋白构建进化树

2.3 基因表达与类黄酮含量的关系

为进一步明确CHS和CHI基因在果实生长发育过程中对类黄酮生物合成所起的作用，分别检测金柑果实生长发育过程中果皮和果肉的类黄酮含量，并通过qRT-PCR检测基因在同一时期的表达水平。从图3可以看出，在花后15、69 d果实中类黄酮含量最高；从花后69 d开始，随着果实生长发育，金柑果皮中类黄酮含量呈现明显下降，而果肉中类黄酮含量呈现先升后降的变化趋势；但总体而言，果皮中的类黄酮含量始终高于果肉中类黄酮含量。

P，果皮；R，果肉。图3～4同

qRT-PCR结果显示(图4)，在金柑果实发育过程中，FmCHS1基因呈先高后低的表达趋势，在15和31 d果实中表达量远远高于其他时期；而FmCHS2则呈降、升、降的变化趋势，其中在69 d果肉和99 d果皮中表达量高于其他组织或时期；FmCHS3表达量在整个果实发育过程中没有明显变化，始终处于低水平、波动的表达模式。在果实发育过程中，FmCHI1的表达在早期缓慢下降，之后呈低水平、波动的表达模式；而FmCHI2呈先上升后下降的变化模式。

图4 金柑果实中3个FmCHS(A)2个FmCHI (B) 基因的相对表达量

3 讨论

查尔酮合成酶和查尔酮异构酶的有关研究已成为一个热点，但大多以模式植物和少数作物为研究对象。在拟南芥中，具催化活性的CHS(tt4，At5G13930)和CHI(tt5，At3G55120)都是单基因编码，且功能已验证。在此基础上，目前的研究逐渐深入到CHS和CHI基因上游调控转录因子的挖掘及翻译后修饰。例如，最近在拟南芥中发现了一个能够与CHS蛋白互作的KFBCHS蛋白，介导CHS的泛素化及降解[28]。KFBCHS的表达显示了组织特异性及时空特异性，并对各种光信号具有很强的响应。拟南芥At5G05270基因编码类型Ⅳ CHI，这类CHI蛋白本身并无催化活性，但它能与类型Ⅰ CHI蛋白互作，提升拟南芥中花青素及类黄酮含量[29-30]。

然而，一些双子叶植物CHS和CHI由多基因编码，使得进一步深入研究变得困难。通过构建进化树进行聚类分析，本实验从金柑中界定了3个CHS，FmCHS1和FmCHS2能与已知功能CHS紧密聚为一类，界定为CHS蛋白；而FmCHS3单独聚类，界定为CHS-like蛋白。最近一项研究，在苹果基因组中界定了3个CHS(MdCHS1、MdCHS2及MdCHS3)，体外酶活性测定发现这3个基因均具有催化活性[31]。此外，本实验发现FmCHI1能与拟南芥CHI/TT5聚类，这个基因可能具有催化活性，FmCHI2界定为类型Ⅳ CHI蛋白。基于前人的研究结果，我们推测FmCHI2能与FmCHI1互作，进而促进类黄酮的合成，但仍有待通过转基因技术等对其进行功能验证。

CHS和CHI是类黄酮合成途径中两个关键酶，定位于整个途径上游。从理论上讲，下游类黄酮合成都受这两个酶的影响。大量研究表明，CHS和CHI基因的表达与类黄酮含量呈现密切关系。最经典的例子为拟南芥tt4和tt5突变体互补实验，Dong等[32]将玉米的CHS(C2)和CHI(CHI1)基因分别导入拟南芥tt4和tt5突变体，发现植物能够积累类黄酮和花青素。相似的情况也发生在将小苍兰CHS(FhCHS1)导入拟南芥tt4突变体[33]。在将FhCHS1导入矮牵牛时，发现矮牵牛花色由白色变为粉红色[23]。在银杏中，CHS表达水平与类黄酮含量之间呈显著正相关[34]。在本研究中，FmCHS1、FmCHS2、FmCHI1和FmCHI2在果实发育过程中均存在一个阶段性高表达，并与类黄酮积累显示一定的相关性，说明这几个基因在金柑类黄酮生物合成中具有重要作用。在金柑果实发育过程中，FmCHS1和FmCHI1表达量较高，与类黄酮积累模式最为接近，因此，它们可能直接参与了金柑果实类黄酮的合成。