川贝母鳞茎组织培养过程中褐化的控制初探

王晓，苏娟，李昆华，韩郸，张万巧，岳健*

(1.云南山里红生物科技有限公司，云南 昆明 6502228； 2.云南青谷生物科技有限公司，云南 昆明 650225)

川贝母(FritillariacirrhosaD. Don)为百合科贝母属多年生草本植物，《中华人民共和国药典》(2015版一部)收载的药材川贝的基源品种之一，主要分布于西藏、云南、四川和青海等海拔1 800～4 200 m的高寒区域[1-2]。川贝母具有清热润肺、化痰止咳、散结消痛的功效[3]，用于肺热燥咳、干咳少痰、阴虚劳嗽、痰中带血等，具有止咳圣药之称[4]，中药处方用量巨大，加上生境特殊且种子休眠期长、自然萌发率低、野生资源过度采挖等原因[3]，川贝母资源不断减少，已被列入国家三级保护植物名单[2]，并且来源物种已被《国家重点保护野生药材物种名录》收录[4]。

相较于传统的繁殖方法，利用组织培养繁殖川贝母能节省育苗用地、提高繁殖系数、缩短育苗周期、维持母种的优良性状[5]，对挽救川贝母处境和产业化生产具有重要的意义。目前，对川贝母的组织培养已有报道[5-7]，但是鲜见关于褐化现象的研究报道[8]。外植体菌类污染、玻璃化、褐化现象已经成为制约药用植物组织培养发展的重要因素，并称为药用植物组织培养三大瓶颈，其中，褐化问题涉及方面复杂[9-10]。本研究以川贝母鳞茎为外植体，通过比较消毒方式、培养条件、褐化抑制剂对川贝母组培褐化影响程度，为川贝母组织培养中控制褐化现象和产业化生产川贝母组培苗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

川贝母外植体来源于云南山里红生物科技有限公司泸西分公司种植基地，于9月至10月取当年生鳞茎。

1.2 方法

1.2.1 外植体准备

采集新鲜野生川贝母鳞茎，用流水冲洗60 min，用洗洁精晃摇清洗5 min，在超净台上消毒处理，无菌水充分清洗，无菌滤纸吸干水分，切成 0.5 cm×0.5 cm的块状[11-13]，接种至培养基，每瓶接种1个鳞茎块，每个处理接种10瓶，重复3次。

1.2.2 培养基和培养条件

以MS培养基为基本培养基，含有激素6-BA 2.0 mg·L-1、NAA 0.2 mg·L-1、蔗糖30 g·L-1、琼脂6 g·L-1，pH值为5.8；光照强度为1 500～2 500 lx，光照周期12 h·d-1，培养温度(25±2)℃；光照培养箱为上海一恒MGC-100；培养30 d后统计外植体褐化率和组培苗获得率。

1.3 处理设计

1.3.1 消毒方式

设置3个处理：1，75%乙醇处理30 s，再用0.1% HgCl2处理10 min；2，75%乙醇处理30 s，再用2%次氯酸钠处理10 min；3，0.1% HgCl2处理5 min，再用2%次氯酸钠处理5 min。

1.3.2 消毒时间

设置6个处理：1，75%乙醇处理30 s，再用0.1% HgCl2处理5 min；2，75%乙醇处理30 s，再用0.1% HgCl2处理6 min；3，75%乙醇处理30 s，再用0.1% HgCl2处理7 min；4，75%乙醇处理30 s，再用0.1% HgCl2处理8 min；5，75%乙醇处理30 s，再用0.1% HgCl2处理9 min；6，75%乙醇处理30 s，再用0.1% HgCl2处理10 min。

1.3.3 培养条件

在超净台上用75%乙醇处理30 s，再用0.1% HgCl2处理10 min；消毒后接种培养基，设置3个处理：1，光照周期8 h·d-1、温度(25±2)℃，暗周期16 h·d-1、温度(15±2)℃；2，光照周期12 h·d-1、温度(25±2)℃，暗周期12 h·d-1、温度为15±2 ℃；3，光照周期16 h·d-1、温度(25±2)℃，暗周期8 h·d-1、温度(15±2)℃。

1.3.4 不同抑制剂处理

在超净台上用75%乙醇处理30 s，再用0.1% HgCl2处理10 min；消毒后接种，设置5个处理：在培养基中分别添加2 g·L-1聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、200 mg·L-1抗坏血酸(VC)、2 mg·L-1柠檬酸(CA)、300 mg·L-1硫代硫酸钠(Na2S2O3)、2 g·L-1活性炭(AC)。

1.4 数据统计

褐化率(%)=褐化株数/接种总数×100；获得率(%)=有效株数(未污染未褐化)/接种总数×100。数据采用Excel 2013和SPSS 21.0软件分析处理。

2 结果与分析

2.1 不同消毒方式处理的效果

以清洗后不做任何消毒处理的川贝母鳞茎接种培养作为空白对照，由表1可知，在相同消毒时间和培养条件下，处理组川贝母鳞茎外植体的褐化程度均大于空白对照组，在所有处理中，采用75%乙醇处理30 s，再用2%次氯酸钠处理10 min的消毒方式对川贝母鳞茎组织培养过程中的褐化情况控制较好，褐化率最低，但组培苗获得率也较低；采用0.1% HgCl2处理5 min，再用2%次氯酸钠处理5 min获得率最高，可见HgCl2的灭菌消毒作用强于次氯酸钠和乙醇，而导致褐化的严重程度则为HgCl2>乙醇>次氯酸钠。

表1 不同消毒方式处理对川贝母组培褐化和获得率的影响

注：同列无相同小写字母表示组间差异显著。表2～4同。

2.2 不同消毒时间处理的效果

将川贝母鳞茎进行清洗后，在超净台上用75%乙醇处理30 s，再用0.1% HgCl2处理不同时间，统计外植体的褐化率和组培苗获得率，通过目视法对褐化程度进行观察并记录结果，结果见表2。随着HgCl2处理时间的延长，其褐化率和褐化程度呈递增趋势；用0.1% HgCl2处理9、10 min时组培苗获得率在最大，但与处理8 min时的获得率无显著差异。培养至第20天时，所有处理均出现有褐化现象，到第30天褐化程度均有加深，0.1% HgCl2处理8 min及以内褐化程度较轻。

表2 不同消毒时间对组培褐化率、获得率和褐化程度的影响

注：—，未出现褐化现象；+，轻度褐化；++，中度褐化；+++，严重褐化。

2.3 不同培养条件处理的效果

以接种后于光照周期12 h·d-1，暗周期12 h·d-1，温度均为(25±2)℃条件下培养作为空白对照组，与空白对照组相比，变温处理试验组的外植体褐化率均显著降低，获得率均显著提高，光照时间越长，褐化率越低，获得率越高(表3)。川贝母为高寒山区生长植物，在低温环境下生长较为适宜，同时，低温环境较好地抑制了川贝母中多酚氧化酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等与褐化相关的酶活性。

2.4 不同抑制剂处理的效果

由表4可知，培养基中添加不同抑制剂对组培褐化现象均有较好的抑制效果，获得率也均有提高。培养基中添加聚乙烯吡咯烷酮(PVP)时，褐化率最低，获得率最高；添加抗坏血酸(VC)、柠檬酸(CA)和活性炭(AC)的试验组褐化率与获得率无显著差异。由于VC和CA对植物生长有一定的促进作用，而AC在吸附褐化物质的同时也会吸附植物生长所需营养物质，因此，添加AC的试验组中出现了种苗坏死现象。

表3 不同培养条件对组培褐化和获得率的影响

表4 不同抑制剂处理对组培褐化和获得率的影响

3 小结与讨论

在植物组织培养过程中，褐化现象的产生有很多因素决定，包括外植体的生理状态和部位、取材的时间和大小、预处理的方式、培养的条件和因素、褐化抑制剂的种类，以及继代转瓶的频率等，通常通过相应的手段来控制植物组织培养过程中的褐化率[14-18]。本研究以诱导率最高的鳞茎作为外植体[17]，研究不同因素对川贝母组织培养中褐化现象的影响，结果表明，试验所用灭菌消毒试剂均能加重受伤外植体的褐化程度，同时，随着消毒灭菌时间的延长，褐化率和褐化程度均有明显的增强，这与庾韦花等[15]的结论一致：随着消毒剂处理时间的延长，褐化率升高。本研究添加的抑制剂均能降低褐化率，其中，添加聚乙烯吡咯烷酮的处理外植体褐化率最低。低温处理可以明显降低川贝母组织培养过程的褐化率，这与王跃华等[19]和赵伶俐等[20]的结论一致。综上，考虑川贝母组培苗的产业化发展方向，以鳞茎作为川贝母组织培养外植体，采用HgCl2和次氯酸钠消毒灭菌8 min，置于添加PVP的培养基中，于光照周期8 h·d-1、温度(25±2)℃，暗周期16 h·d-1、温度(15±2)℃条件下培养，能够较好地控制川贝母鳞茎组织培养过程中的褐化率，同时提高组培植株的获得率。

本研究发现，川贝母外植体接种20 d之后才会出现褐化现象，增殖阶段的褐化率高于前期，而变温培养能够明显推迟褐化的发生，降低褐化率，同时促进川贝母鳞茎的组织培养过程，并且温度的变化对川贝母外植体褐化控制的影响程度较其他因素明显。笔者也对培养基成分、浓度、外植体种类进行了对比试验，结果发现，培养基的成分和浓度对川贝母鳞茎的褐化率影响较小；以茎段、叶片、针形幼苗作为外植体均不同程度出现褐化，褐化率差异不明显，而诱导率差异较明显。本研究中空白对照组的褐化率也不低，推测是由于对外植体的切割处理造成了伤口，而伤口的存在会提高褐化出现的概率[9]，因此，后期可以考虑使用完整鳞茎接种进行组织培养，以降低褐化概率。