普境安对细粒棘球绦虫虫卵的作用效果

郝力力，阳爱国，袁东波，郭莉，侯巍，莫茜，尹杰，张朝辉，徐林，余劲，王潇，何能杰，李锐

(1.西南民族大学 生命科学与技术学院，四川 成都 610041； 2.四川省动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041；3.甘孜州动物疫病预防控制中心，四川 甘孜 626000； 4.河南普爱饲料股份有限公司，河南 商水 466100；5.成都杰鑫玛生物科技有限公司，四川 成都 610041； 6.浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，浙江 杭州 310021)

四川省甘孜州是全世界包虫病高发地区，包虫病不仅严重危害当地居民健康，而且导致很多包虫病患者所在家庭因病返贫，严重制约了当地社会经济的发展。细粒棘球绦虫属于圆叶目，犬科动物(家犬、流浪犬、狼、狐)是终末宿主和唯一传染源[1-2]。成虫在犬科动物小肠内发育成熟，排出虫卵，虫卵内含六钩蚴，对人和其他中间宿主(牛、羊)具有感染力。值得注意的是，细粒棘球绦虫的虫卵对外界不良环境抵抗力很强，尤其耐受低温：-80 ℃ 7 d方能彻底灭活，7 ℃可存活200 d以上，21 ℃可存活50 d[3-4]。甘孜州大部分地区属亚寒带高原气候，全年气温偏低，日照长，昼夜温差大，非常适合环境中细粒棘球绦虫虫卵的长期存活。此外，甘孜州全州总计18个县，牧业县占比高，牧民家家养犬，阳性犬只的粪便极易污染牧场、地表水源以及周边居住环境，导致人畜容易从环境中摄入虫卵而感染包虫病。因此，鉴于上述情况，迫切需要一种高效的消毒剂，对环境中的虫卵进行抑制杀灭，降低人畜摄入虫卵的风险，保障当地居民的健康。

普境安(Stalosan F)是由丹麦Stormollen公司研发的一款干粉生物安全卫生产品，对各种病原微生物均有较好的杀灭抑制效果。该产品采用特殊的加工工艺，将所有成分加工到接近纳米级微粒再进行结合，最终产品呈超微粒状态。普境安可采用专门的喷洒设备，按照所需覆盖面积来计算所用剂量，均匀覆盖于物体表面，可强力吸附环境中的病原体，从而彻底破坏微生物的生存环境，达到抑制、杀灭病原微生物的目的[5]。普境安对人畜无任何副作用，已上市50多年，对鸡球虫、猪蛔虫等寄生虫虫卵、苍蝇虫卵、真菌(曲霉菌、黄曲霉菌等)、细菌(大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等)和病毒(禽流感、蓝耳病、犬细小病毒和猪细小病毒等)均有较好的控制效果[6]。因此，本实验拟就普境安对细粒棘球绦虫虫卵的抑制、杀灭效果展开初步研究，确定普境安能否有效地杀灭细粒棘球绦虫虫卵或者减低虫卵的活力，从而为提高包虫病流行地区公共卫生水平、保障当地居民健康提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

主要仪器设备和试剂。台式高速离心机(eppendorf 5402型)、ABI7500荧光PCR仪、Nanodrop 2000、TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix(北京全式金公司)、Trizol(Invitrogen)，引物和探针由华大基因合成。

犬粪样本的采集。于2017年9月，在石渠县采集驱虫后3 d内的新鲜家犬粪便30份，每份150 g左右，4 ℃冷藏保存。

1.2 处理设计

阳性犬粪的筛选。将30份犬粪每份均充分混匀，每份取100 mg按照Trizol说明书提取总RNA备用。针对细粒棘球绦虫ND1基因，设计合成以下引物和探针(MGB)：Pf: 5′-TGTACTGGTTGG GGTGGTTACAA-3′；Pr:5′-GCCTCAAACCTAACAG ATCCAAAA-3′；Probe: 5′-CACATCGAACAGACCT T-3′。采用上述引物和探针，建立如下PCR反应体系：上下游引物各3 μL(终浓度600 nmol·L-1)、探针1 μL(终浓度400 nmol·L-1)、PCR Mix 12.5 μL、RNA 3～4 μL(10 ng)、ddH2O补齐至25 μL。于ABI7500荧光PCR仪上运行反应，选取Ct值小于20的犬粪样本备用。

普境安对虫卵最佳作用效果对应剂量和处理时间的确定。选取Ct值小于20的犬粪样本1份，将普境安分为50、80和100 g·m-23个剂量组，处理时间分别为4、8、12和24 h，同时设置1个空白对照组(未用普境安处理)，总计4个实验组(图1)。每组取犬粪6 g，均匀平摊于90 mm无菌平皿内，按照对应剂量将普境安均匀覆盖于犬粪上，温箱内18 ℃下放置。在4个时间点，每组分别取大约1 g犬粪提取总RNA，按照上述反应体系进行检测，做3个复孔，确定Ct值。

1.3 数据分析

采用SPSS 19.0对不同处理组和空白对照组的Ct值进行卡方分析，判定是否存在显著差异。

2 结果与分析

结果如表1所示，对照组在4、8、12和24 h Ct值变化区间为18.32～19.45，无明显变化；和对照组相比，50 g·m-2剂量组4个时间段Ct值无明显变化；80 g·m-2剂量组在12和24 h有明显变化，其中作用24 h后差异显著(P<0.05)；100 g·m-2剂量组在作用8、12和24 h后Ct值有明显变化，其中作用12和24 h后差异极显著(P<0.01)。

表1 不同普境安处理组作用不同时间后对应的Ct值

注：*、**分别表示与对照相比差异达到显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)水平。

3 讨论

普境安对寄生虫虫卵的抑制机理主要为以下2方面：1)其纳米级成分(硅酸盐成分)可渗透至虫卵内部，改变其内部的pH值，从而干扰DNA的复制，切断了幼虫的发育过程；2)普境安颗粒改变了虫卵表面的通透性，造成了内部水分的流失，虫卵脱水死亡，达到了抑制和杀灭的作用。Permin等[6]将普境安处理过的鸡蛔虫、鸡异刺线虫和封闭毛细线虫的虫卵接种鸡后，和未处理组相比，鸡体内成虫数量明显减少，说明普境安对虫卵有亚致死作用，能够一定程度上抑制虫卵发育为感染性幼虫。Ralph等[7]发现，采用50 g·m-2剂量作用于未孢子化的堆型艾美耳球虫卵囊48 h后，和对照组相比，孢子化率下降了50%。

本实验中发现，100 g·m-2作用24 h后，犬粪中细粒棘球绦虫虫卵ND1基因转录水平显著降低，表明对虫卵活力有显著的抑制作用。甘孜州18个县均为包虫病流行区域，前期相关调查发现，土壤、犬被毛上均检出虫卵[7]，因此，采用普境安对定居点周边土壤、草场以及人活动的广场等重点区域进行消毒，是降低人畜感染包虫的有效措施。细粒棘球绦虫的虫卵与球虫、蛔虫虫卵(需要在外界环境中进行发育：球虫孢子化，蛔虫虫卵进一步分裂，有明显的形态变化)不同，排出到外界环境中时就已经发育成熟，形态上不再有明显变化，因此，无法直接从形态上判定普境安对虫卵的抑制效果。在后续研究中，可从犬粪中分离富集细粒棘球绦虫虫卵，按照不同剂量/时间组合作用后，接种中间宿主绵羊，依据绵羊体内脏器上包囊个数及发育程度来进一步确定普境安最佳剂量/作用时间组合。由于细粒棘球绦虫虫卵对人和家畜有感染性，因此，对绵羊的攻虫实验至少需要在BSL-2实验室进行，这也是目前未能开展动物实验的主要原因。

由于普境安的特殊作用机制，即使长期使用，病原微生物也不会产生抗药性；和其他消毒剂不同，普境安即使在有机物存在的条件下，也能充分发挥作用，而且可以进行带畜消毒，对人畜无害(吸入、食入、皮肤接触及眼部接触均无害)，不会产生生态破坏，非常适合包虫病流行地区使用。到目前为止，普境安对细粒棘球绦虫虫卵杀灭抑制效果国内尚无相关报道，本实验进行了前期研究，以期为包虫病的防控提供行之有效的技术措施。