枣属ITS及psbA-trnH序列PCR反应体系的优化与验证

李学营，索相敏，白瑞霞，彭建营，马宝玲

（1.河北农业大学园艺学院，河北 保定 071001；2.河北省农林科学院石家庄果树研究所，河北 石家庄 050061；3.河北省农业特色产业技术指导总站，河北 石家庄 050000）

ITS序列是核糖体DNA中位于18S、5.8S和26S之间的转录间隔区，由ITS1和ITS2组成。ITS高度重复、长度保守，变异速度较快，可提供丰富的变异位点和信息位点，在植物系统分类和进化研究中被广泛应用。被子植物中ITS（包括5.8S）片段的长度在700 bp左右，加上协同进化（concerted evolution），使得该片段在基因组不同重复单元间十分一致，非常适合进行各种分子操作[1]。目前，ITS可能是分子系统学研究中应用十分广泛的基因之一[2]。叶绿体基因为母性遗传，基因组较小，但包含大量的DNA成分，在分子水平上差异明显，能为比较进化研究提供基本的信息支持，所涉及的叶绿体基因主要有两类，编码基因及非编码区序列20种以上[3～17]，已越来越多地应用在分子进化和分子系统学研究中。其中，psbA-trnH序列是植物叶绿体基因组中的非编码区序列，比较适合属下种间的划分，但是单独基于psbA-trnH序列进行植物系统学分析的报道甚少，将ITS序列与psbA-trnH序列一起进行研究，能够提高研究的准确性和科学性。

枣属 （Ziziphus Mill.） 是鼠李科 （Rhamnaceae）中最具经济价值的一个属，主要分布在亚洲的热带和亚热带。枣是我国的第一大干果树种，已成为农业经济增收的重要来源之一。我国枣资源较为丰富，其中原产于我国的种有14个。近年来，在枣属属下分类的研究中尽管涉及到形态学、生物学、同工酶及花粉学等多个方面[18，19]，但大多是针对枣和酸枣进行的，而针对我国其他枣属植物的ITS及psbA-trnH序列研究尚未见报道。通过不同的反应条件，建立枣属植物的ITS和psbA-trnH序列高效一致的PCR反应体系，旨为后续的枣属比较分子生物学研究提供更可靠的分子生物学依据。

表1 供试材料及其来源Table 1 Materials and their origins

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料共13种，包括原产于我国的枣属12种和1个近缘种斯氏铜钱树（表1）。7～8月采其嫩叶，用硅胶干燥保存，带回实验室，备用。

1.2 试验方法

1.2.1 总DNA的提取 采用改良CTAB法[20]，通过Nano Drop 2000c超微量紫外分光光度计并结合1%琼脂糖凝胶电泳测定基因组DNA的浓度和质量。TE溶液稀释至250 ng/μL，-20℃保存，备用。

1.2.2 ITS和psbA-trnH序列PCR反应体系的优化设计 ITS和psbA-trnH序列均采用双引物 （表2）扩增。

以毛果枣、蜀枣和褐果枣3个试材的总DNA为样品。参考其他树种和作物的扩增体系，确定总反应体积为50 μL，内含dNTP 0.2 mmol/L、Mg2+2 mmol/L、双引物各60 ng、TaqDNA聚合酶1.5 U和不同的叶片总DNA模板量（设50、100、200 ng共3个处理），之后用重蒸水补足。PCR扩增反应程序为：①94℃预变性2 min；②94℃变性1 min，退火温度分别设57、55、52和48℃（即4个退火温度处理），退火1 min，72℃延伸1 min。循环35次；③保持72℃10 min。不同的退火温度及不同的DNA模板量组合共设12个处理（表3）。

表2 ITS和psbA-trnH引物序列的信息Table 2 Sequence of ITS and psbA-trnH primers

表3 对ITS和psbA-trnH PCR扩增时不同退火温度与DNA模板用量的组合处理Table 3 The annealing temperature and DNA amount in PCR reaction system for ITS and psbA-trnH amplification

以溴酚蓝为指示剂，PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，并用0.5 μg/mL EB染色显影，在紫外透射仪下观察并拍照。

1.2.3 ITS和psbA-trnH序列PCR反应优化体系的验证采用优化后的反应体系，对枣属12个种和1个近缘种共13份材料进行PCR扩增、纯化及测序进行验证。

PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪检测，切下目的片断，然后采用DNA纯化回收试剂盒（上海生工）回收目的片段，回收的PCR产物在-20℃保存，用于测序。

测序工作由上海生物工程有限公司负责完成，测序原理是Sanger的双脱氧终止法，测序仪为ABI377。采用PCR产物直接测序，测序引物与PCR扩增引物一致，2条序列的测序程序均为95℃20 s—50℃20 s—60℃1 min，30个循环。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA的质量与检测

所得DNA溶液的A260/A280为1.7～1.9，DNA产量为690～720 ng/μL。说明DNA样品中基本无蛋白质污染，并无降解现象。

2.2DNA模板量对PCR产物的影响

在50 μL反应体系中，ITS及 psbA-trnH序列DNA模板量为50～200 ng时，相同退火温度下，同一序列内3个材料间不同DNA模板用量处理的PCR产物亮度一致，无明显差异。说明在一定范围内，DNA模板的用量对PCR扩增影响不大。因此，从节约成本的角度考虑，在50 μL反应体系中，DNA模板的用量在50 ng时就能扩增出高质量的PCR产物（图1和2）。

图1 不同条件下ITS序列的PCR扩增产物电泳图Fig.1 Electrophoregram of PCR products for ITS sequence under different conditions

图2 不同条件下psbA-trnH序列的PCR扩增产物电泳图Fig.2 Electrophoregram of PCR products for psbA-trnH sequence under different conditions

2.3 退火温度对PCR扩增产物的影响

从2条序列的PCR扩增产物看，不同退火温度间同一序列的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，条带亮度和粗度都存在差异。

当退火温度为48℃时，2个PCR产物条带都较亮，但出现了明显的弥散拖尾现象。说明除了扩增出目的PCR产物外还出现了许多的杂带，降低了扩增的特异性。这将大大影响后续试验，给纯化和测序带来了困难。退火温度为48℃时并不适合对枣属ITS和psbA-trnH序列的PCR扩增。

当退火温度为57℃时，ITS序列的PCR产物条带较弱；退火温度为55和52℃时条带较亮，其中，52℃处理的带型最好，条带明亮，粗细适中，没有杂质。说明退火温度为52～55℃时ITS序列均能扩增出质量较高的PCR产物，其中，最佳退火温度为52℃。

当退火温度为57和55℃时，psbA-trnH序列的PCR产物条带都较弱，亮度不够，说明退火温度为57和55℃时不能有效地扩增出足够的PCR产物；退火温度为52℃时，条带明显较亮，且无杂带，说明退火温度为52℃最佳。

从试验结果看，扩增时psbA-trnH片段要求的退火温度较ITS序列更为严格。

2.4ITS和psbA-trnH序列PCR反应优化体系的验证

根据确立的最适PCR反应条件，对枣属12个种和1个近缘种共13份材料的ITS及psbA-trnH序列进行了扩增。结果（图3和4）显示，PCR扩增后的电泳条带清晰，无杂带，扩增效果良好。说明优化后的PCR反应体系稳定、可靠，可用于枣属植物系统发育的研究。

图3 ITS序列的PCR扩增产物电泳图Fig.3 Electrophoregram of PCR products for ITS sequence with optimized condition

图4 psbA-trnH序列的PCR扩增产物电泳图Fig.4 Electrophoregram of PCR products for psbA-trnH sequence with optimized condition

在优化PCR反应体系下扩增的ITS和psbA-trnH序列完全符合测序的要求，经纯化后测得的序列完整，正反双向测序后对比完整，质量较高，已经提交Genebank数据库。

3 结论与讨论

ITS和psbA-trnH序列测序是基于PCR的分子技术，而影响PCR反应的因素有很多，如dNTP、Mg2+、TaqDNA聚合酶等对扩增效率均有一定的影响。对ITS和psbA-trnH序列的PCR研究中，前人对于dNTP、Mg2+、TaqDNA聚合酶用量的优化较为成熟。

模板DNA质量和浓度是影响PCR扩增效果的关键因素之一，PCR体系中模板DNA浓度范围较大，但浓度过低或者过高均会对扩增效果产生不良影响[23]。选择适宜的模板浓度对建立稳定的PCR体系很重要，杨培奎等[24]对橄榄ISSR-PCR反应体系优化时认为，不同物种不同PCR体系中，适宜的模板DNA浓度范围存在差异，进行PCR体系优化时仍有必要将模板DNA作为影响因素。每个物种的DNA长度不同，不同PCR操作中对模板DNA浓度要求上有一定差异。本研究条件下对枣属ITS和psbA-trnH序列扩增时发现，在一定范围内模板DNA用量对PCR产物影响不大，在利用ITS和psbA-trnH序列进行系统学研究中较少的模板DNA可以扩增出质量较高的PCR产物。这对于采样量困难的植物或标本，基于ITS和psbA-trnH序列进行分析更具有优势。本研究中，对于模板DNA的用量梯度并没有达到最低用量的极限。

对于ITS和psbA-trnH序列PCR体系优化的研究少有报道，但对于其他分子标记的PCR体系进行优化的研究中，许多学者对退火温度进行了优化。退火温度的高低直接影响到PCR产物的质量和数量，不同分子标记、不同引物、不同材料之间存在差异，最佳退火温度各不相同。本研究中，扩增时psbA-trnH片段要求的退火温度较ITS序列更为严格，但两段序列的最佳退火温度相同。

综上所述，枣属ITS及psbA-trnH序列优化后的PCR反应体系为：50 μL反应体系中，内含dNTP 0.2mmol/L，Mg2+2 mmol/L，2条引物各60 ng，TaqDNA聚合酶1.5 U，叶片总DNA模板50 ng。反应程序为：①94℃预变性2 min；②94℃变性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min。循环35次；③最后72℃延伸10 min。