贵州土鸡中 ALV-J、REV和 MDV的混合感染

林汉卿,温贵兰,汪德生,张升波,徐 丽,李昌红

(1.贵州大学动物科学学院,贵州 贵阳 550025;2.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室,贵州 贵阳 550025)

禽白血病、网状内皮组织增生症和马立克病是禽类最为常见的3种肿瘤病,可导致家禽出现严重的免疫抑制,继发感染其他疾病,对养禽业危害巨大。出现混合感染时,疾病的致病力和致肿瘤能力都远大于单一感染,导致的免疫抑制也更为严重。禽白血病由禽C型反转录病毒科的禽白血病病毒(ALV)引起,根据病毒囊膜糖蛋白gp85抗原性的差异,ALV可分为A～J 10个亚群,J亚型禽白血病病毒(ALV-J)是最近较为流行的外源性病毒,可引起鸡的骨髓细胞瘤。禽网状内皮组织增生症病毒是RE的病原,主要引起鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑等产生急性网状细胞增生、矮小综合征及免疫器官萎缩。根据与单克隆抗体反应的差异,将REV分为I、II和III型3种不同亚型,我国目前流行的REV以III型为主。鸡马立克病(MD)的特征是淋巴组织增生性紊乱,病原为鸡马立克病病毒(MDV)。依据其生物学特性可将MDV分成3个血清型,其中只有血清1型MDV(MDV-1)具有致病力。Witter等人[1]依据毒株毒力的不同,将 MDV-1进一步分为温和毒(mMDV)、强毒(vMDV)、超强毒(vvMDV)及特超强毒(vv+MDV)。MDV的致瘤相关基因有meq基因、pp38基因、vTR基因等,其中meq基因为MDV-1特有[2]。MDV的毒力和致瘤能力都有逐渐增强的趋势,对疫苗的抵抗力也在增加。近年来,各个地区陆续出现两种或3种肿瘤病混合感染的报道,肿瘤病发展得越来越复杂,防控难度也在增大。2017年8月,贵州省某土鸡养殖场发生了一起以步态不稳、歪脖、鸡冠肿瘤为特征的传染性疾病,经病理剖检、PCR鉴定和序列分析,判定该鸡场存在禽白血病、网状内皮组织增生症和马立克病的混合感染。

1 材料与方法

1.1 材料 病毒材料为贵州省某鸡场送检的土鸡组织病料,大肠埃希菌DH5α,购自碧云天生物技术公司;2 ×EsTaqMaster Mix、pMD-18T、连接酶 Solution I、DL-2 000 Marker,购自宝生物工程(大连)有限公司;HiFiScript cDNA Synthesis Kit试剂盒,购自康为世纪生物科技有限公司,RNA提取试剂盒,购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司,琼脂糖凝胶回收试剂盒,购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2 方法

1.2.1 流行病学调查 询问养殖户鸡群信息,观察送检病鸡的临床表现,仔细检查病鸡皮肤有无异常。在无菌条件下解剖病鸡,观察病理变化并记录。

1.2.2 引物设计 参照GenBank数据库中登录的ALV-J原型毒株 HPRS-103(GenBank登录号：Z46390)的gp85基因序列、MDV美国毒株 RBIB(GenBank登录号：AY243332.1)的meq基因序列和REV的SNV株(GenBank登录号：DQ003591)的env基因序列,用Primer Premier 5.0软件分别设计3对特异性引物。引物的碱基序列见表1,引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

表1 引物信息

1.2.3 PCR鉴定 按常规方法提取病鸡组织RNA并反转录,用设计的3对引物分别对所得cDNA进行PCR扩增,反应体系为：cDNA 2 μL,2×Es TaqMaster Mix 12.5 μL,上下游引物各 1 μL,ddH2O 8.5 μL,反应程序如下：95℃预变性4 min;94℃变性30 s,58℃退火1 min,72℃延伸1 min,共33个循环;72℃再延伸10 min。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 目的基因的克隆与序列测定 PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定后,利用胶回收纯化试剂盒分别纯化回收PCR产物,用Solution I连接酶将3个纯化产物与pMD-18T载体16℃连接过夜,并转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞中。菌液在含氨苄的固体培养基上培养12 h后,挑取单个菌落纯培养,取2 μL菌液为模板进行PCR扩增及电泳检测,将鉴定结果为阳性的菌液送至广州立菲生物公司测序。

2 结果与分析

2.1 流行病学调查结果 送检鸡场每天的死亡数为10多只,鸡群免疫过禽流感疫苗和新城疫疫苗,未免疫马立克病疫苗,鸡群发病后使用过很多抗菌药物,均无明显效果。送检鸡为130日龄左右,病鸡出现呼吸困难、站立不稳、歪脖等现象(见中插彩版图1),肉髯肿瘤结节(见中插彩版图2),剖检可见心脏、脾脏(见中插彩版图3)、肠系膜等处有明显的肿瘤结节。肝脏有明显出血点,肾脏、脾脏明显肿大,腺胃、肌胃和气管有不同程度的出血。

图1 病鸡出现歪脖现象

图2 肉髯肿瘤结节

图3 脾脏灰白色结节

2.2 ALV-Jgp85基因PCR扩增结果及序列分析

gp85基因扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测,扩增出约921 bp的特异性条带,与预期条带一致。克隆后送出测序,将所得序列命名为GZ2017-ALV。用DNAStar7.1生物学软件比对,核苷酸同源性分析显示,GZ2017-ALV跟J亚型毒株HuB09JY04、GZD17的核苷酸同源性最高,都为99.3%,与J亚型原型毒株NXO1O1的同源性为96.7%,与其他亚型的同源性仅有45.3% ～47.2%。遗传进化树显示(图4),GZ2017-ALV与J亚型毒株GX13LT02亲缘关系最近,与其他J亚型毒株都处于同一大分支,与A、B、D、E亚型毒株均处于不同分支。

图4 ALV gp85基因核苷酸序列的遗传进化树分析

2.3 REVenv基因PCR扩增结果及序列分析REVenv基因经扩增后,出现约615 bp的特异性条带,与预期条带一致。克隆后送出测序,得到618 bp大小的碱基序列,编码206个氨基酸,将其命名为GZ2017-REV。与GenBank上传的 REV分离株进行比对,GZ2017-REV与分离株CY1111和2012001-2的核苷酸同源性最高,为95.1%,与Ⅲ型代表株CSV的核苷酸同源性也相对较高,为94.5%,与Ⅰ型代表株170A的核苷酸同源性为92.1%,与Ⅱ型代表株SNV的核苷酸同源性则相对较低,为90.7%。遗传进化树结果显示(图5),GZ2017-REV与2012001-2处于同一小分支,与CSV和170A处于同一大分支,SNV则与HQSC2024和GD1210在另一分支。

图5 REV env基因核苷酸序列的遗传进化树分析

2.4 MDVmeq基因PCR扩增结果及序列分析MDVmeq基因经扩增后,出现与预期条带一致的约522 bp的特异性条带。克隆后测序得到522 bp大小的序列,编码174个氨基酸,命名为 GZ2017-MDV。将其与GeneBank上的16株分离株比对分析,核苷酸同源性高达98.5% ～99.6%。与美国vvMDV代表株RBIB的核苷酸同源性为98.9%,与vv+MDV代表株N的核苷酸同源性则为99.4%(图6)。

3 讨论

禽白血病、网状内皮组织增生症和马立克病是目前危害我国养鸡业最严重的3类肿瘤病,随着病毒的进化,3种肿瘤病之间的混合感染越发严重,病毒间相互的协同作用使得病毒更难以控制。近几年来,各地相继出现了鸡传染性贫血病病毒、传染性腔上囊病病毒等与ALV、REV、MDV的混合感染[3-5],但贵州省还未见ALV、REV、MDV混合感染的报道。根据病理变化、PCR鉴定和序列分析结果,可判定贵州省某鸡场发生了 ALV-J、REV和 MDV的混合感染。

ALV-J于2000年首次在中国分离到,宿主范围广泛、进化迅速,目前已成为最为流行的禽白血病病毒亚型。gp85基因作为决定亚群特异性的主要蛋白,在ALV-J的进化和变异中起到了至关重要的作用[6]。分析显示,A～E亚群相互间的gp85基因的同源性大于80%,而J亚群与其他亚型间gp85基因的同源性只有40%左右,因此常选用gp85基因来鉴别ALV-J[7]。本试验测序得到的GZ2017-ALV的gp85基因跟GenBank中J亚型ALV标准毒株的gp85基因同源性为96.7% ～99.3%,与其他亚型的同源性仅有45.3% ～47.2%,说明流行株GZ2017-ALV是J亚型禽白血病病毒。REV作为一种反转录病毒,不仅能整合到宿主的基因组中垂直传播给下一代,还能整合到MDV基因组中引起复杂的混合感染[8],因此难以根除,目前尚无有效的防控办法。根据与单克隆抗体反应的差异,REV可分为3型,I、II、III型的代表株分别为 170A、SNV、CSV,我国内地的REV流行株以III型为主[9],也有部分为I型,II型REV鲜有报道。流行株GZ2017-REV与170A、SNV、CSV的核苷酸同源性分别为92.1%、90.7%和94.5%,遗传进化树表明其与170A、CSV的亲缘关系相对较近,说明GZ2017-REV很可能是目前较为流行的III型REV。MD不仅是一种肿瘤病,还能侵害动物的神经。本试验的病鸡出现头颈歪斜很可能是控制颈肌的神经受害引起的,呼吸困难可能是由于迷走神经受到侵害,而步态不稳则是由于坐骨神经受侵害,这也是MD的典型症状。meq基因作为公认的致肿瘤相关基因,与MDV的毒力有一定关联,且保守性较强,是近年的研究热点[10-11]。对病鸡的meq基因进行克隆和序列分析,结果表明,流行株GZ2017-MDV与各分离株的核苷酸同源性为98.5% ～99.6%,与vv+MDV代表株N的核苷酸同源性高达99.4%,说明GZ2017-MDV是特超强毒株的可能性比较大。

目前AL和RE都没有有效疫苗,市面上虽有MD疫苗,但MDV毒力的不断增强,以及ALV和REV两种病毒对动物机体的侵害,使得疫苗的免疫效果减弱,常出现免疫失败。要阻止肿瘤疾病的传播,种群净化必不可少。