新孢子虫及其致病机制的分子基础

刘 晶,张西臣,朱兴全,刘 群

(1.中国农业大学动物医学院,北京 海淀 100193;2.吉林大学动物医学学院,吉林 长春 130012;3.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室,甘肃 兰州 730046)

新孢子虫病(Neosporosis)是由新孢子虫(Neospora caninum)感染多种动物的原虫病,在全世界广泛分布[1]。我国多个省市自治区均有流行,不同地区血清阳性率差异显著[2]。新孢子虫隶属于顶复亚门,孢子虫纲,真球虫目,肉孢子虫科,新孢子虫属,是1988年才被确认的一种动物寄生原虫。新孢子虫感染会引起孕畜流产、死胎及新生儿运动神经功能障碍,主要危害牛和犬,也会引起山羊、绵羊和鹿的临床感染[3]。新孢子虫是引起牛繁殖障碍最重要的病原之一,引起的流产和新生犊牛的死亡导致全球养牛业遭受重大经济损失。鉴于新孢子虫病对养牛业的重大威胁,开发有效保护的疫苗迫在眉睫。目前唯一一种商品化的全虫灭活疫苗(BOVILIS NEOGUARDTM),对防止流产有很好的保护效果,但不能阻断垂直传播,且由于保质期短和高生产成本等问题并未广泛应用。因此需要对新孢子虫进行更深入的基础研究,找到更有效的靶点。2015年立项的国家重点基础研究发展计划(973计划)项目“牛、羊重要寄生虫致病机制的分子基础”(项目编号：2015CB150300)将新孢子虫作为重要研究对象之一,旨在通过对致病机制的研究,为新孢子虫病新型药物、疫苗、诊断方法的研制提供理论基础。

1 新孢子虫的生活史

新孢子虫是专性细胞内寄生原虫,完成其全部生活史需要两个宿主。犬和其他犬科动物是新孢子虫的终末宿主[4]。新孢子虫的中间宿主非常广泛,哺乳动物、海洋哺乳动物和鸟类等都可以感染[5]。生活史以3个感染阶段为代表,分别是速殖子、组织包囊和卵囊。速殖子和组织包囊出现在中间宿主体内,速殖子呈月牙形,约6×2 μm。速殖子可以侵入多种有核细胞,包括巨噬细胞和淋巴细胞,可通过血液循环迅速扩散到全身并在体内多种细胞内进行繁殖。在免疫系统正常的宿主体内,虫体可由活跃的速殖子转换为生长缓慢的缓殖子,最终形成组织包囊。组织包囊主要存在于中枢神经系统(CNS),呈圆形或椭圆形,一般为15～35 μm×10 ～27 μm,最大可达107 μm,内含20 ～100 个缓殖子。终末宿主吞食了中间宿主体内的组织包囊,虫体进入终末宿主小肠内完成类似球虫样的有性生殖,形成约10～12 μm大小的卵囊,随粪便排出体外,在外界适宜的温度和湿度下经48～72 h发育为感染性卵囊。中间宿主吞食了被感染性卵囊污染的饮水或饲料而被感染(见中插彩版图1)。

图1 新孢子虫生活史[6]

2 新孢子虫的传播途径和危害

新孢子虫病对牛的危害最为严重,主要造成孕畜流产、死胎以及新生幼畜的神经系统功能障碍。新孢子虫在中间宿主群中有两种传播方式：垂直传播和水平传播。摄入卵囊感染是中间宿主与终末宿主之间的主要水平传播途径,肉食动物摄入其他动物组织中的包囊是另一种水平传播;垂直传播则是速殖子经胎盘感染胎儿,是妊娠期母牛到胎牛的传播方式。垂直传播被认为是牛群中新孢子虫传播的最主要和更有效的途径[7]。尽管新孢子虫不能通过精液传播,但是新孢子虫感染的公牛精子浓度、活力和运动性均显著降低[8]。垂直传播可以是母牛食入外源性卵囊导致的急性感染,也可能由于孕期免疫状态的改变激活了隐性感染母牛体内的缓殖子,转换为速殖子再经胎盘传播。成年牛感染新孢子虫后没有任何临床症状,但当孕牛持续感染至怀孕时包囊内的缓殖子转换为速殖子快速增殖导致组织受损,胎盘发生病理变化,可引起母体流产并直接危及胎儿生命。最严重的病理变化多发生在胎盘和胎儿脑部,胎牛表现为非化脓性脑脊髓炎的典型病变。流产多发生于妊娠3个月到妊娠后期,妊娠3～8个月的胎儿流产时常见不同程度的自溶;妊娠5个月内死亡的胎儿若未及时排出死胎,则在子宫中滞留数月形成木乃伊胎;妊娠早期发生死亡的胎儿则可能被母体吸收而被忽视。若没发生流产则产下的犊牛或出现神经症状,严重者表现为四肢无力、后肢麻痹、运动失调,头部震颤明显,反射迟钝;或大部分新生犊牛临床表现健康,但存在隐性感染。这些隐性感染的犊牛在成年妊娠时,组织包囊内的缓殖子可能活化,导致流产发生或者继续传给子代,如此往复,新孢子虫得以在牛群中持续感染,严重威胁牛群繁殖,生产性能大大下降。

新孢子虫在不同地区、同一地区不同牛场的感染率差异很大。新孢子虫感染引起的流产存在地区散发性和流行性两种方式,爆发性流产不常见。如果某牛场在6～8周内流产风险超过10%,则被认为是一种流行性流产。而流产在某个牛群中持续存在数月甚至数年,则为地方性流产。新孢子虫病所致流产可以全年反复发生,无明显的季节性。大部分新孢子虫引起的流产都发生在妊娠第4～6个月,流产的奶牛将错过一个泌乳期。因此,孕牛感染新孢子虫造成流产的损失相当于一头犊牛和泌乳期牛奶的损失。

牛新孢子虫病给养殖业带来的巨大经济损失,包括流产导致的直接经济损失,也包括流产母牛淘汰率增加、流产奶牛的护理和重新繁育成本增加、产奶量下降、更换饲料和牛舍等成本的间接经济损失。每年因新孢子虫病在澳大利亚、巴西、墨西哥和美国造成的损失均超过1亿美元。越来越多的证据表明,新孢子虫感染或许会导致母牛终生带虫,且其大部分后代也可能获得先天感染。因此,新孢子虫病的危害不仅是导致牛群繁殖障碍,更重要的是牛一旦感染新孢子虫,可通过垂直传播方式在牛群中散播,导致群体内持续感染该病原,也就意味着流产可能不断发生,是非常严重的潜在威胁。

3 诊断与防控

鉴于新孢子虫对牛的危害最为严重,诊断常是针对牛新孢子虫病的诊断。应对牛场流行病学情况、牛的临床症状、检测或分离病原的情况,结合分子生物学及免疫学方法进行综合诊断。同时要考虑混合感染其他繁殖障碍疾病的可能,以及与弓形虫病的鉴别诊断。新孢子虫病原的分离和鉴定是最有力的直接证据。但新孢子虫的分离成功率很低,直接从病料涂片检出率更低。病理组织学配合免疫组织化学的方法可以确认新孢子虫的存在。分子生物学诊断则利用PCR扩增新孢子虫的特异性基因,如Nc5、14-3-3、ITS1等,主要应用于检测流产胎牛等中间宿主组织内的虫体。血清学诊断应用于动物活体检测,包括直接凝集试验(DAT)、乳胶凝集试验(LAT)、免疫印迹技术(WB)、免疫胶体金技术(ICT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等,其中ELISA操作简单规范,结果的判定不受主观因素的影响,更适用于大批量血清样本的血清流行病学调查。

新孢子虫至今仍没有理想疫苗可以使用,也没有能够彻底清除感染的特效药物。虽然磺胺类、乙胺嘧啶等药物对虫体具有一定的杀伤效果[3],但是药物均不能有效杀灭包囊阶段虫体,且出于对耐药性及药物残留的考虑,这些药物在控制奶牛新孢子虫感染中的应用受到了极大限制。针对新孢子虫在牛群中的流行状况,淘汰病牛防止新孢子虫病垂直传播是最为有效的方法。同时,切断水平传播途径,禁止用流产胎牛喂犬,禁止犬进入牛场,以防排出的卵囊污染水源和饲料。此外,通过日常规范管理,在引进奶牛时做好检验检疫工作,防止引入新孢子虫阳性牛。

4 新孢子虫感染与致病的分子机制

随着国家973计划相关项目的顺利开展,新孢子虫感染与致病分子机制的研究取得了重要阶段性成果。通过生物信息学分析,从分泌蛋白包括棒状体蛋白、微线体蛋白和致密颗粒蛋白中筛选出多个拟毒力因子,利用新孢子虫基因调控平台的Crispr/Cas9技术和同源重组技术,获得了基因调控虫株。通过对表型和毒力的观察,确定毒力因子并深入探讨其功能和分子作用机制。目前已经明确ROP5、ROP16、NcMIC6和 GRA16为新孢子虫毒力因子。缺失这些基因的虫株增殖能力和对小鼠的致病力均明显下降。其中ROP5通过抑制细胞免疫因子GBP1和GBP2向虫体纳虫空泡膜聚集,抵抗免疫细胞对虫体的杀伤能力,介导新孢子虫的免疫逃避[9]。ROP16是新孢子虫激活宿主细胞STAT3的重要蛋白,依赖其核定位信号进入核内持续磷酸化STAT3,其磷酸激酶结构域是发挥磷酸化功能的关键[10]。MIC6以 NcMIC1/4/6复合体的形式存在,在虫体入侵宿主细胞时会从虫体前端移至后端,在新孢子虫入侵和逸出过程中发挥作用[11]。GRA17定位在纳虫空泡膜上,参与新孢子虫的小分子跨膜运输,对维持纳虫空泡形态稳定起重要作用,氨基端参与将GRA17运输到致密颗粒,α螺旋与GRA17定位于纳虫空泡膜有关[12]。

对宿主抗新孢子虫先天免疫机制进行的探讨发现,巨噬细胞衍生的细胞外陷阱(ETs)是宿主抵抗新孢子虫早期感染的有效机制[13],感染新孢子虫的巨噬细胞能够激活NLRP3炎性体,并在宿主抗新孢子虫中发挥作用[14]。新孢子虫14-3-3蛋白可通过激活MAPK、AKT和NF-κB信号通路诱导有效的免疫应答并刺激细胞因子表达,是抗新孢子虫病的新型候选疫苗[15]。

我国学者对新孢子虫及新孢子虫病的研究,在国内外同类研究中处于领先地位。对新孢子虫毒力因子和宿主抗新孢子虫先天免疫机制的研究将为阐明新孢子虫致病的分子机制奠定基础。但有效防控牛的新孢子虫病任重而道远,关于新孢子虫致病分子机制的研究还在继续进行中,这些研究结果将为发现新的抗新孢子虫药物和开发有效疫苗、诊断方法提供坚实的理论基础。