二维液相色谱法测定烧烤肉制品中苯并（a）芘

梁剑锋 李亚 梁峰

摘 要：烧烤肉制品由于富含动物油脂，在炭火高温烧烤熟制品过程中，容易出现苯并（a）芘超标问题，具有较高安全隐患。建立二维液相色谱仪检测烧烤肉制品中苯并（a）芘的方法。第1维为分离、富集柱，采用Inertsil ODS柱（4.6 mm×150 mm，5 ?m），流动相为乙腈-水（85∶15，V/V），流速1.0 mL/min，可以实现500 ?L样品中目标物苯并（a）芘的富集与分离;第2维采用ChromSpher Pi柱（3.0 mm×80 mm，5 ?m），流动相为异丙醇-乙腈（60∶40，V/V），流速1.2 mL/min，可以有效分离、测定样品中的苯并（a）芘。结果表明：烧烤肉制品中苯并（a）芘在1.0～20.0 ng/mL范围内呈线性关系，其线性回归方程为y=1.847 1x-0.103 3（r=0.999），检出限为0.08 μg/kg，在1.00、3.00、5.00、10.00 ?g/kg加标水平下，加标回收率为97.1%～105.2%，相对标准偏差为1.55%～2.77%。

关键词：烧烤肉制品;苯并（a）芘;二维高效液相色谱;柱切换

Abstract： During the high-temperature grilling of barbecued meat products over charcoal fire， the problem of benzo（a）pyrene

production in amounts exceeding the safety limit occurs easily due to their richness in animal fat， which is a high potential safety hazard. A method for the determination of benzo（a）pyrene in barbecued meat products by two-dimensional liquid chromatography was established. The first dimension allowed the separation and enrichment of benzo（a）pyrene from 500 μL of samples using an Inertsil ODS （4.6 mm ×150 mm， 5 ?m） column with a mobile phase consisting of acetonitrile-water （85：15， V/V） at a 1.0 mL/min flow rate; the second dimension was intended to effectively separate and detect benzo（a）pyrene in samples using a ChromSppi column （3.0 mm × 80 mm， 5 ?m） with a mobile phase consisting of isopropanol-acetonitrile （6：4， V/V） at a flow rate of 1.2 mL/min. The results showed that the linear regression equation was y=1.847 1x-0.103 3 （correlation coefficient r = 0.999） with good linearity over the concentration range of 1.0–20.0 ng/mL. The detection limit was 0.08 μg/kg. The recovery of benzo（a）pyrene spiked at concentration levels of 1.00， 3.00， 5.00 and 10.00 ?g/kg was 97.1%–105.2% with relative standard deviation （RSD） of 1.55%–2.77%.

Keywords： barbecued meat; benzo（a）pyrene; two-dimensional liquid chromatography; column switching

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190313-055

中图分类号：TS251.7                                         文獻标志码：A 文章编号：1001-8123（2019）05-0055-05

引文格式：

梁剑锋， 李亚， 梁峰. 二维液相色谱法测定烧烤肉制品中苯并（a）芘[J]. 肉类研究， 2019， 33（5）： 55-59. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190313-055.    http：//www.rlyj.net.cn

LIANG Jianfeng， LI Ya， LIANG Feng. Determination of benzo（a）pyrene in barbecued meat products by two-dimensional liquid chromatography[J]. Meat Research， 2019， 33（5）： 55-59. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190313-055.    http：//www.rlyj.net.cn

苯并（a）芘（benzoapyrene，BaP）是一种五环芳香烃化合物[1-2]，不溶于水，易溶于苯、丙酮等有机溶剂，被国际癌症研究机构列为Ⅰ类强致癌物质[3-4]。苯并（a）芘的产生主要有2 个途径：1）在缺氧、高温、不完全燃烧条件下，食品中的碳水化合物、脂肪、蛋白质等有机物经过热裂解、环化、聚合等复杂的化学反应产生苯并（a）芘，特别是在油炸、烧烤等高温制作过程中发生焦糊的食品中，苯并（a）芘含量比普通食品高10～20 倍[5-7];

2）煤炭、石油产品等燃料不完全燃烧也会产生苯并（a）芘，通过污染土壤[8-9]、水、空气进入到食品中[10-11]。

熏烧烤肉制品是将畜禽肉、鱼肉等原料经过腌制后，以烟气、高温空气、明火或高温固体为媒介加热制成的熟肉制品，可分为熏烤类和烧烤类2 种。由于熏烤肉制品香气诱人、美味适口，一直是人们爱吃的传统食品。不过，熏烧烤食物中含有一些致癌物质，经过研究发现其中主要的致癌物质为苯并（a）芘[12-14]。熏烤食品时所使用的熏烟中就含有苯并（a）芘等多环芳烃类物质，其来源主要有：1）熏烤所用的燃料木炭含有少量的苯并（a）芘，在高温下有可能伴随烟雾侵入食品中;2）烤制时，滴于火上的食物脂肪焦化产物发生热聚合反应，形成苯并（a）芘，附着于食物表面，这是烤制食物中苯并（a）芘的主要来源;3）熏烤的鱼或肉等自身的化学成分，即糖和脂肪的不完全燃烧也会产生苯并（a）芘

及其他多环芳烃;4）食物炭化时，脂肪因高温裂解，产生自由基，并相互结合生成苯并（a）芘[15-16]。目前的研究对苯并（a）芘的形成机理尚不十分清楚。澳大利亚学者Badger 1960年提出苯并（a）芘的形成步骤：首先是在高温缺氧条件下，有机物裂解产生碳氢自由基，结合生成乙炔，然后经聚合作用形成乙烯基乙炔或1，3-丁二烯，再经环化作用生成己基苯，再进一步合成丁基苯和四氢化萘，最后通过中间体形成苯并（a）芘[17-18]。

由于苯并（a）芘的强致癌性，目前各国对食品中苯并（a）芘的残留有严格的控制。例如，德国对肉制品中苯并（a）芘的残留限量标准为1.0 ?g/kg，我国国家食品安全标准GB 2762—2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》[19]中规定，烟、熏、烤肉制品中苯并（a）芘

限量值为5.0 ?g/kg[20-22]。熏烤肉制品中的苯并（a）芘残留量安全问题日益突显，建立快速、准确、高效的烧烤肉制品中苯并（a）芘检测方法，对保障烧烤肉制品安全性十分重要。

目前，食品中苯并（a）芘的检测方法主要有薄层色谱法、荧光分光光度法、高效液相色谱法[23-24]、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法及免疫学检测法等[25-26]。薄层色谱法和荧光分光光度法样品前处理繁琐﹑耗时长﹑试剂消耗量大，而且只能粗略定量;高效液相色谱法具有操作简单﹑定量准确﹑重现性好等优点，是目前检测苯并（a）芘最常用的方法[27-29]。按照GB 5009.27—2016《食品安全国家标准 食品中苯并（a）芘的测定》对熏烧烤肉制品进行处理并检测其苯并（a）芘含量时，在处理时需要将样品经过苯并（a）芘分子印迹柱净化﹑氮吹仪浓缩，而且还需使用大量的二氯甲烷这一毒害性高的试剂，导致操作复杂、分析时间长、消耗溶剂多、危险性高。近年来，二维色谱分离技术已经被越来越多地应用到食品分析中[30-32]，本研究建立一种二维液相色谱测定烧烤肉制品中苯并（a）芘含量的方法，无需使用高毒性有机试剂与固相小柱，简化前处理步骤，具有经济、高效的特点。

1 材料與方法

1.1 材料与试剂

市场上烧烤摊售卖的烧烤肉制品5 批。二氯甲烷（色谱纯）、正己烷（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、异丙醇（色谱纯）、苯并（a）芘标准品（质量浓度20 μg/mL） 农业部环境保护科研监测所;MIP-BAP苯并（a）芘专用固相萃取印迹柱（500 mg、6 mL） 德国CNW公司。

1.2 仪器与设备

1260 Infinity二维液相色谱仪（配备2 个高压二元泵、1 个六通阀、荧光检测器）、色谱柱1（岛津Inertsil ODS柱（4.6 mm×150 mm，5 ?m））、色谱柱2（ChromSpher Pi柱（3.0 mm×80 mm，5 ?m）） 美国安捷伦科技有限公司;Quintix 224-1CN电子天平 德国赛多利斯公司;AllegraX-15R离心机 美国贝克曼库尔特有限公司;J2正压固相萃取仪 北京普利泰科仪器有限公司。二维液相系统内部组成结构和阀门切换系统如图1所示。

A. 系统利用第1根色谱柱对样品进行分离;B. 系统利用第2根色谱柱对样品进一步分离后进检测器检测。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的绘制

准确吸取25.0 ?L苯并（a）芘标准品（质量浓度20 μg/mL）于10 mL容量瓶中，用正己烷-异丙醇（1∶1，V/V）定容，得到质量浓度分别为50 ng/mL的苯并（a）芘标准中间液;分别取质量浓度为50 ng/mL的标准中间液0.20、0.50、1.00、1.50、2.00 mL于10 mL容量瓶中，用正己烷-异丙醇（1∶1，V/V）定容，得到质量浓度分别为1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 ng/mL的标准工作液，现配现用。标准曲线的绘制：以标准溶液质量浓度为横坐标（x），标准溶液峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线，进而得到线性回归方程及线性相关系数和范围。

1.3.2 样品前处理

称取经绞碎、混匀的样品2.5 g（精确到0.000 1 g）于具有塑料塞的15 mL离心管中，用正己烷-异丙醇（1∶1，V/V）稀释至5.0 mL，摇匀，涡旋混合0.5 min，使样品混合均匀;4 000 r/min、4 ℃冷冻离心4 min，取上清液，用0.22 μm有机相微孔滤膜过滤，弃去初滤液，续滤液进液相小瓶，即得供试样品溶液，待测。

1.3.3 色谱条件

在图1中的二维液相色谱分析系统中，在进样的3.5 min内，色谱柱1进行第1维分离，主要作用是将样品中的非目标物和大部分基体杂质（蛋白质、脂肪等）与苯并（a）芘分离，同时采用大体积进样，使苯并（a）芘

分析物在色谱柱1富集;在进样的3.5 min后，通过六通阀切换系统，将色谱柱1切入第2维检测系统，通过流动相的变化将色谱柱1上的苯并（a）芘进行洗脱，并在色谱柱2上进一步分离检测。色谱柱1采用岛津Inertsil ODS柱（4.6 mm×150 mm，5 ?m），色谱柱2采用ChromSpher Pi柱（3.0 mm×80 mm，5 ?m）。泵1和色谱柱1为第1维分离，流动相为乙腈-水（85∶15，V/V），流速1.0 mL/min;泵2和色谱柱2为第2维分离，流动相为异丙醇-乙腈（60∶40，V/V），流速1.2 mL/min，柱温均为40 ℃。检测器：荧光检测器;激发波长384 nm;发射波长406 nm;进样量500 μL（采用500 μL定量环进样）。进样后系统切换阀处于图1A所示状态，进样3.5 min后，系统切换阀切换至图1B所示状态，测定完成后系统切回到图1A所示状态，平衡3 min后进行下次测定。

1.4 数据处理

实验所得数据、谱图采用Thermo Scientific? Dionex? Chromeleon? 7.2 SR4色谱数据系统软件进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 二维液相色谱仪六通阀切换时间考察

在仪器第1维、第2维分析中，第1维采用岛津Inertsil ODS色谱柱，其在第1维分析中起到分离杂质、富集样品中苯并（a）芘的作用，第2维色谱柱在第1维分离杂质的基础上，采用苯并（a）芘分析专用色谱柱安捷伦ChromSpher Pi柱进行进一步分离与分析，为样品中苯并（a）芘的定量分析柱。T. 样品色谱图;S. 苯并（a）芘标准溶液色谱图。

由图2可知，当第1维以乙腈-水（85∶15，V/V）为流动相时，样品的基体杂质流出时间在3 min内，目标物

苯并（a）芘流出时间约为3.25 min后，目标物与基体杂质基本能够分离。根据图2确定分析系统中的六通阀切换时间为3.5 min，如果提前切换阀门，则会给第2维液相带入比较多的基体杂质，不利于第2维液相的分离与检测;如阀门切换时间推后，将导致部分目标分析物流入废液池，方法的回收率显著降低。

2.2 方法学考察

2.2.1 线性范围

将不同质量浓度的标准工作液，依次从低质量浓度到高质量浓度进样，通过已知质量浓度的标准溶液对应的峰面积，得出线性回归方程。结果表明，方法在苯并（a）芘质量浓度1.0～20.0 ng/mL范围内呈线性关系，质量浓度范围与国标方法一致，线性回归方程为y=1.847 1x-0.103 3（r=0.999），表明线性良好。

2.2.2 检出限

准确称取样品2.5 g（精确到0.000 1 g），加入0.10 mL质量浓度为50 ng/mL的苯并（a）芘标准中间液，按照1.3.2节的前处理方法处理样品，用高效液相色谱仪观察苯并（a）芘目标色谱峰信噪比（RS/N）和对应苯并（a）芘添加量，RS/N>3时对应的添加量为方法的检出限。按上述方法处理，当样品中添加苯并（a）芘0.08 ?g/kg时，苯并（a）芘RS/N为4.3，色谱图如图3所示，则方法的检出限为0.08 ?g/kg。检出限为各化合物的3 倍信噪比（RS/N=3），结果表明，苯并（a）芘RS/N>3，可以确定方法的检出限为0.08 μg/kg，优于国家标准（0.1 μg/kg）。

2.2.3 方法回收率与精密度

对市场上购买的烧烤肉制品进行测试，采用标准添加法进行准确度与精密度实验，分别进行高、中、低水平添加，每个添加水平测定6 次。

由表1可知，本方法回收率为97.1%～105.2%，相对标准偏差为1.55%～2.77%，与国标方法的回收率和相对标准偏差接近，实验结果符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》[33]对准确度和精密度的要求，表明该方法对烧烤肉制品中苯并（a）芘的提取、检测是稳定的，具有良好的准确度和精密度。

2.3 实际样品的测定

从市场上购买5 份烧烤肉制品，分别采用本方法和GB 5009.27—2016中的方法进行测定，每份样品重复测定5 次。

由表2及图4可知，在对市场上购买的5 份实际样品进行检测时，与国标方法相比，本方法的检测结果、标准偏差及变异系数与国标方法一致。

3 结 论

通过采用六通阀搭建的二维液相分析系统，将烧烤肉制品的中苯并（a）芘检测的前处理简单化，样品加入正己烷、异丙醇溶剂稀释﹑过滤后，直接进样分析，利用六通阀切换在线去除样品杂质，提高了检测效率，无需用到有毒有机溶剂，减少了操作时对身体的伤害，降低了检测成本，方法的检出限、准确度及精密度等指标均与国标方法相一致，可以应用于烧烤肉制品等容易受到苯并（a）芘污染食品的安全检测。

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收稿日期：2019-03-13

第一作者简介：梁剑锋（1982—）（ORCID： 0000-0001-5626-2534），男，高级工程师，硕士，研究方向为食品安全检测。E-mail： ljf117117@163.com

*通信作者简介：李亚（1983—）（ORCID： 0000-0001-8546-2594），女，工程师，硕士，研究方向为食品安全检测与控制。E-mail： 123906970@qq.com