不同月龄乌珠穆沁羊MyHC基因与脂肪及共轭亚油酸含量的相关性

薛宝玲 栗丽萍 杨晶 格日勒图

摘 要：不同品种羊肉中的共轭亚油酸与肉品质关系密切，能够影响羊肉的滋味、气味及营养价值等品质指标。基于肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MyHC）相关基因在动物体骨骼肌中的表达及肌纤维与MyHC相关基因的特异性，采用实时荧光定量聚合酶链式反应技术测定乌珠穆沁羊MyHC基因的相对表达量，测定脂肪含量，用气相色谱法测定共轭亚油酸总含量。结果表明：MyHCⅠ基因与MyHCⅡa基因的相对表达量与脂肪含量及共轭亚油酸总含量的变化趋势相对一致;MyHCⅡb和MyHCIⅡx基因的表达量均在12 月龄时达到最大值;脂肪含量6～12月龄最高，共轭亚油酸总含量在6 月龄达到最高值，然后下降且变化显著（P<0.05）;乌珠穆沁羊6 月龄时肉质相对其他月龄较佳。

关键词：乌珠穆沁羊;MyHC基因;脂肪;共轭亚油酸

Abstract： Conjugated linoleic acids （CLA） in sheep meat have a close association with meat quality， affecting meat quality parameters like taste， odor and nutritional value. Given the specific expression of the myosin heavy chain （MyHC） genes in the various types of muscle fibers， the MyHC relative expression levels in the skeletal muscle of Ujumqin sheep were determined by real-time PCR， and its lipid content was measured as well as its CLA content by gas chromatography （GC）. The results showed that the relative expression levels of MyHC I and MyHC IIa and lipid and CLA levels exhibited consistent trends with increasing age of sheep. The expression levels of MyHC IIb and MyHC IIx reached the maximum at 12 months of age. The highest lipid content was found in lambs from 6 to 9 months of age; the highest CLA level at 6 months， which then decreased significantly （P < 0.05）. From this study， it is concluded that meat quality in Ujumqin lambs slaughtered at 6 months of ages was better than older and younger ones.

Keywords： Ujumqin sheep; MyHC genes; fatty; conjugated linoleic acid

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190115-012

中图分类号：TS251.1                                      文獻标志码：A 文章编号：1001-8123（2019）05-0024-05

引文格式：

薛宝玲， 栗丽萍， 杨晶， 等. 不同月龄乌珠穆沁羊MyHC基因与脂肪及共轭亚油酸含量的相关性[J]. 肉类研究， 2019， 33（5）： 24-28. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190115-012.    http：//www.rlyj.net.cn

XUE Baoling， LI Liping， YANG Jing， et al. Correlation between myosin heavy chain （MyHC） gene expression and lipid and conjugated linoleic acid contents in skeletal muscle during the growth of Ujumqin sheep[J]. Meat Research， 2019， 33（5）： 24-28. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190115-012.    http：//www.rlyj.net.cn

不同的基因能够编码相对应的肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MyHC）[1-3]。Chang[4]、Eggert[5]等研究表明，可以将Ⅰ型、Ⅱa型、Ⅱb型和Ⅱx型肌纤维与MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡb、MyHCⅡx 4种MyHC异构体进行一一对应。肌纤维与MyHC异构体分型是依据肌纤维与MyHC相关基因的特异性[6-7]以及MyHC相关基因在骨骼肌中的翻译表达[8-10]。

共轭亚油酸是含有共轭双键的混合物的通称[11-12]，有几何异构体和位置异构体2 种[13-14]。羊肉中的脂肪及共轭亚油酸含量直接关系着羊肉的滋气味及营养价值[15-17]，并且对羊肉品质而言意义重大。在动、植物性产品中共轭亚油酸存在较为普遍，并且其含量在动物性产品中较高[18-21]。反刍动物自身能够合成共轭亚油酸，其含量高于其他动物[22-23]。

自然放牧条件下的乌珠穆沁羊是蒙古羊系统中的优良品种[24-25]。本研究对1～18 月龄（除15 月龄外）的乌珠穆沁羊股二头肌MyHC基因与脂肪及共轭亚油酸总含量的变化特性进行研究，旨在掌握乌珠穆沁羊不同生长阶段股二头肌中MyHC基因与脂肪及共轭亚油酸含量的变化规律，为改善和提升羊肉肉质提供可靠的参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

除15 月龄外，选取每隔3 月龄的1～18 月龄乌珠穆沁羊股二头肌（n=3）。迅速分装样品，置于冻存管中，在液氮中迅速冷冻，保存于-80 ℃。

核酸染料 北京百奥莱博科技有限公司;反转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链式反应（real time-polymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒、Trizol（总RNA抽提试剂）、焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC） 宝日医生物技术（北京）有限公司;氯仿 廊坊拓迪化工有限公司;异丙醇 南京新源化工有限公司;蔗糖 深圳市康初源有限公司。

1.2 仪器与设备

TF通风柜 山东创博实验室装备有限公司;ZYMICRO-I-10T超纯水仪 四川卓越水处理设备有限公司;GC-2014C气相色谱仪、石英毛细管柱Rt-2560（100 m×0.25 mm，0.20 μm） 日本岛津公司;GC126氢火焰离子检测器 深圳市三利化学品有限公司;HJ-6多头磁力加热搅拌器 常州亚特实验仪器有限公司;RE-301旋转蒸发器 河南省巩义市瑞力仪器设备有限公司;SHZ-D Ⅲ循环水真空泵 江苏省太仓市三江塑业有限公司;移液枪 上海心亮实业有限公司;GRX-9053A热风消毒箱 上海精密仪器仪表公司;ACCULAB ALC分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MyHC相关基因的相对表达量测定

1.3.1.1 总RNA的提取（Trizol试剂法）

从骨骼肌提取总RNA，参考Trizol试剂法（低温离心条件均为4 ℃、12 000 r/min）[26]。

少量多次添加液氮研磨200～300 mg股二头肌，使样本处于冷冻状态;将100 mg样品放入1.5 mL无酶无菌EP管，加入1 mL Trizol溶液，-4 ℃放置8 min;低温离心5 min后吸出上层溶液，加入约1/5体积的氯仿，剧烈摇动混合物15 s，并室温静置至无分相沉淀;低温离心15 min后，吸出上层溶液并注入等体积异丙醇溶液，室温静置10 min;低温离心10 min，倒掉上层溶液，得白色RNA胶状沉淀;加入DEPC处理的75%乙醇1 mL，洗涤沉淀;低温离心5 min后，弃上清;倒置干燥，加入20～50 μL RNase-free水溶解沉淀，-80 ℃静置;取5 μL RNA与2 μL Loading Buffer溶液混合均匀，以确定总RNA质量的完整性、浓度和纯度。将样品RNA的质量浓度统一调至500 ng/μL后，于-80 ℃冰柜中保存。

1.3.1.2 反转录利用TaKaRa反转录试剂盒。

第1步：去除基因组DNA：配制总量为10.0 μL的试剂，其中加入2.0 μL 5×gDNA消除缓冲液、1.0 μL gDNA消除液及500 ng/μL的模版RNA，体系最终剩余量加入DEPC处理的去离子水。

第2步：合成cDNA第一链：配制总量为20.0 μL的试剂，其中加入4.0 μL 5×缓冲液（用于实时荧光定量）、1.0 μL逆转录酶与1.0 μL混合引物、4.0 μL DEPC处理的去离子水及10.0 μL第1步的反应液。

反应条件如下：合成cDNA第一链需将配制的20.0 μL反应物于3 个梯度下进行反应：37 ℃恒温反应15 min;85 ℃反应5 s;4 ℃时进行无限循环。

1.3.1.3 引物设计及合成

在NCBI中查找绵羊MyHC基因的核苷酸序列[10]，并使用Primer Premier 5.0软件对引物进行分析、设计与合成。

1.3.1.4 RT-PCR

利用CFX96 TM Real Time System PCR系统进行反应;以反转录的cDNA为模板，看家基因β-actin为内参，每个样品3 个重复。PCR程序：95 ℃预变性30 s，变性5 s，60 ℃退火30 s，共38 个循环。基因的相对表达量采用公式（1）[27]计算。公式对所有的测试样和校准样用内参基因的循环阈（cycle threshold，Ct）值归一目标基因的Ct值，最终计算表达量。

ΔCt测试样=Ct目标测试样-Ct内参测试样，ΔCt校准样=Ct目标校准样-

Ct内参校准样，用校准样本的ΔCt值归一测试样本的ΔCt值：ΔΔCt=ΔCt测试样-ΔCt校准样。

1.3.2 脂肪含量测定

1.3.2.1 样品处理

将1 cm3在液氮中速冻的股二头肌样品粉碎成末，三角瓶中加入15 g样品和210 mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V），振摇2.5 h，浸泡8～10 h后过滤;加入5 mL 20%的NaCl于滤液中，静置，弃上清液，加入无水Na2SO4脱水，在旋转蒸发器中45 ℃水浴蒸发浓缩，得到脂肪[28]。

1.3.2.2 总脂肪含量测定

在15 mL离心管中氮吹干燥浓缩脂肪，离心管质量稳定时可按照公式（2）计算获得总脂肪的含量。

式中：X总脂肪为试样中总脂肪酸的含量/（mg/100 g）;Xi为各脂肪酸含量/（mg/100 g）。

1.3.3 共轭亚油酸的测定

采用气相色谱的方法对共轭亚油酸含量进行测定[29]。初始温度120 ℃，维持8 min，以4 ℃/min升至260 ℃，在此温度下保持30 min;入口温度260 ℃，检测器温度290 ℃;高纯氮（99.999%）作为载气;氢气发生器流速45 mL/min，恒定柱流速1.2 mL/min，分流比22∶1，進样量1.0 μL。

1.4 数据处理

采用SAS 9.2与SPSS 19.0统计软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 总RNA质量浓度和纯度

OD280 nm是蛋白质和酚类物质最高吸收峰的光密度值，比值可进行核酸样品纯度评估：OD260 nm/OD280 nm=1.8为纯DNA，OD260 nm/OD280 nm=2.0为纯RNA。若样品中含有蛋白质及苯酚等物质，OD260 nm/OD280 nm值会明显下降。防止蛋白质及苯酚残留污染时应防止移液枪吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够[30-31]。

由表1可知，所有月龄的乌珠穆沁羊股二头肌样品OD260 nm/OD280 nm值均介于1.8～2.0，表明提取的RNA在随后的实验中可用。

2.2 RNA的质量评定

由图1可知，采用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量，可以观察到3 个条带，分别为28S核糖体RNA、18S核糖体RNA和5S核糖体RNA，3 个条带中上面2 个较为清晰的条带为28S核糖体RNA和18S核糖体RNA。28S和18S核糖体RNA条带明亮、浓度较大，在18S核糖体RNA条带下方可观察到稍微扩散的条带，它由低分子质量的RNA组成，说明RNA几乎没有被降解，在反转录的合成和RT-PCR中可使用。

2.3 引物设计及合成

MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡb、MyHCⅡx和β-actin基因上游与下游的引物序列、产物片段大小和退火温度如表2所示。

2.4 MyHC基因的RT-PCR产物

RT-PCR总体系为25 μL，其中含灭菌的ddH2O 8.5 μL、cDNA模板2 μL、上游引物（10 μmol/L）1 μL、下游引物（10 μmol/L）1 μL、SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）12.5 μL。由图2可知，β-actin、MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡb及MyHCⅡx基因产物的长度分别为233、165、200、216、284 bp，且从Marker上进行对比可知，扩增出的目的基因大小与预期相一致，且没有其他杂带，表明目的基因片段产生了明显的特异性扩增条带，所设计的引物特异性较好，符合后续的实验要求。

2.5 MyHC基因的RT-PCR扩增曲线

由图3～4可知，β-actin、MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡb和MyHCⅡx基因的RT-PCR扩增曲线及溶解峰表明，MyHC相关基因和看家基因序列都没有产生重峰，均为单峰，MyHC相关基因的引物特异性良好，没有出现非特异性扩增序列，也没有产生引物二聚体。

2.6 MyHC基因的相对表达量

由表3可知：MyHCⅠ基因的相对表达量为6 月龄>3 月龄>1 月龄>9 月龄>12 月龄>18 月龄，在1～6 月龄的股二头肌中呈上升趋势;MyHCⅡb基因的相对表达量在12 月龄达到最高值，6 月龄为最低值;MyHCⅡa基因的相对表达量在18 月龄达到最高值，1 月龄为最低值;MyHCⅡx基因的相对表达量6 月龄达到最低值，经过6 个月后12 月龄达到最高值。

2.7 股二头肌的脂肪含量

由表4可知，乌珠穆沁羊股二头肌脂肪含量在6～12 月龄达到最高值，1 月龄为最低值，且差异显著（P<0.05），可知随着月龄的增加，股二头肌脂肪含量总体呈现增加趋势。

2.8 股二头肌的共轭亚油酸总含量

由表5可知，不同月龄乌珠穆沁羊股二头肌中共轭亚油酸总含量随着月龄的增加先上升后降低，在6 月龄时达到最高值。共轭亚油酸能够影响羊肉的滋味、气味及肉质等多种特性[32-33]，根据乌珠穆沁羊不同月龄股二头肌中共轭亚油酸的总含量，可推测6 月龄时乌珠穆沁羊羊肉品质优于其他月龄。

3 结 论

对不同月龄段乌珠穆沁羊股二头肌MyHC相关基因相对表达量、脂肪与共轭亚油酸总含量进行测定，结果表明：MyHCⅠ基因的表达水平在6 月龄达到最高值，随后开始降低;MyHCⅡa基因的表达水平在18 月龄达到最高值;MyHCⅡb和MyHCⅡx基因的表达水平在12 月龄时达到最高值。股二头肌脂肪含量在6～12 月龄最高，共轭亚油酸总含量在6 月龄达到最大值，随后下降，可见月龄是对乌珠穆沁羊肌肉中的脂肪与共轭亚油酸含量具有显著影响的因素。

每年年初，乌珠穆沁地区进入冬季产羔季节，1～18 月龄的乌珠穆沁羊要经过一个比较寒冷的阶段。外界环境、不同生长阶段及羊群的活动等因素变化，可能导致共轭亚油酸总含量的变化与不同MyHC基因之间的不规律转化。随着月龄的增加，乌珠穆沁羊MyHCⅠ基因与MyHCⅡa基因的相对表达量、脂肪含量及共轭亚油酸总含量的变化相对一致。乌珠穆沁羊6 月龄时的肉质相对其他月龄较佳。

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收稿日期：2019-01-15

第一作者简介：薛宝玲（1988—）（ORCID： 0000-0002-8877-8639），女，讲师，硕士，研究方向为农产品加工及贮藏工程。E-mail： xuebaoling880212@163.com