人ADSCs移植对大鼠急性重症胰腺炎的治疗作用及其机制

唐楠，谭雪莹，张德国，黄飞，史光军

(1 潍坊医学院，山东潍坊261000；2 青岛大学附属青岛市市立医院；3 大连医科大学)

急性重症胰腺炎(SAP)是临床常见的急危重症，起病急骤，病情凶险，是外科急腹症中最棘手的疾病之一。目前，对于SAP的发病机制尚不完全清楚，一般认为与胰腺自身消化引起的瀑布式炎症级联效应有关；对于SAP的治疗主要采取非手术为主的个体化综合治疗，如胃肠减压、抑制消化液分泌、液体复苏等对症支持治疗。近年随着治疗方法的改进，SAP的临床救治成功率不断提高，但其病死率仍然在10%左右[1，2]。干细胞移植是将具有自我复制能力的多潜能细胞移植到患者体内,修复或替换受损细胞或组织，从而达到治疗疾病的目的。有研究报道，通过尾静脉移植骨髓间充质干细胞(BMSCs)能够减轻SAP大鼠胰腺炎症反应[3]。但BMSCs来源匮乏，不适合治疗性研究。脂肪间充质干细胞(ADSCs)是来源于脂肪组织的多潜能细胞，其作用效果与BMSCs相似，而且组织相容性复合体Ⅰ低表达，可逃避免疫系统识别，无需配型[4]。此外，脂肪组织来源广泛，ADSCs取材容易[5]。有研究发现，在大鼠体内ADSCs向胰岛细胞分化、增殖和迁移的能力均明显优于BMSCs[6，7]。本课题组前期研究证实，ADSCs能明显减轻SAP大鼠胰腺炎症反应。但对ADSCs治疗SAP的具体作用机制仍不十分清楚。2018年5～6月，本研究观察了人ADSCs对大鼠SAP的治疗作用及其可能的作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠45只，清洁级，鼠龄40～50 d，体质量200～230 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物许可证号：SCXK(鲁)20140007。所有大鼠分笼饲养，每笼5只。饲养环境温度18～25 ℃、相对湿度40%～60%，光照12 h明暗交替。实验期间自由摄食、饮水。人ADSCs由青岛市市立医院肝胆胰外科细胞移植实验室冻存。所有PCR引物由北京赛百盛基因技术有限公司设计合成。Light Cycle96实时荧光定量PCR仪，瑞士Roche公司；流式细胞仪，美国BD公司。PrimeScript RT Reagent Kit，日本TaKaRa公司；iQTMSYBR Green Supermix，美国Sigma公司；兔抗鼠磷酸化β-actin(p-β-actin)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、磷酸化核因子κB(p-NF-κB)一抗，沈阳万类生物科技有限公司；HRP标记的山羊抗兔IgG二抗，南京生兴生物技术有限公司。

1.2 动物分组处理 所有SD大鼠适应性喂养1周，随机分为假手术组、模型组、移植组，每组15只。各组术前禁食12 h，自由饮水。模型组、移植组异氟烷吸入麻醉，经上腹剑突下正中切口入腹，用微型血管夹夹闭胆总管近肝门处，按胰胆管逆行注射牛磺胆酸钠法[8]建立SAP模型。当观察到胰腺充血、水肿，移植组用注射器于胰腺被膜下注射密度为1×106个/mL的人ADSCs悬液300 μL后关腹。模型组观察到胰腺充血、水肿后关腹。假手术组开腹后经胰胆管逆行注射台式液。

1.3 各组腹水量与血清淀粉酶、TNF-α检测 ①腹水量检测：移植组于移植6、12、24 h分别取5只，假手术组与模型组同期各取5只，异氟烷吸入麻醉满意后，平卧位固定于手术台上，开腹，用5 mL注射器抽取腹水，记录腹水量。②血清淀粉酶、TNF-α检测：抽取腹水后，心尖部采血，4 ℃静置3 h，3 000 r/min离心10 min，取上层血清。采用ELISA法检测血清淀粉酶、TNF-α。

1.4 胰腺组织形态学观察 各组心尖部取血后，断颈处死，迅速完整分离胰腺组织。取部分胰头组织，4%多聚甲醛固定，常规脱水、包埋、切片、HE染色，显微镜下观察胰头组织形态学改变。

1.5 胰头组织p-AKT、p-NF-κB mRNA与蛋白表达检测 ①胰头组织p-AKT、p-NF-κB mRNA表达检测：采用RT-PCR法。取血清淀粉酶、TNF-α水平变化最明显时胰头组织，采用TRIzol法提取组织总RNA，经紫外分光光度计鉴定，OD260/OD280为1.8～2.0，可进行后续实验。按PrimeScript RT Reagent Kit说明将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，按iQTMSYBR Green Supermix说明进行PCR扩增。引物序列：p-AKT上游引物5′-GTGCTGGAGGACAATGACTACGG-3′，下游引物5′-AGCAGCCCTGAAAGCAAGGA-3′；p-NF-κB上游引物5′-CTACTGTTCAGTGTTCAAGCAGTGA-3′，下游引物5′-CAGTGCAATATAGCATTGCAGTAGC-3′；β-actin上游引物5′-GCCAACCGTGAAAAGATG-3′，下游引物5′-CCAGGATAGAGCCACCAAT-3′。PCR反应体系共10 μL：2×Easy Taq PCR Supermix 5 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，双蒸水1 μL；反应条件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s共30个循环，最后72 ℃ 10 min。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。②胰头组织p-AKT、p-NF-κB蛋白表达检测：采用Western blotting法。取血清淀粉酶、TNF-α水平变化最明显时胰头组织，RIPA裂解液冰上充分裂解，提取组织总蛋白，经BCA法蛋白定量合格。然后加入4×上样缓冲液，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分变性。取变性蛋白12 μg，经SDS-PAGE分离蛋白(5%浓缩胶、10%分离胶)，80 V电压电泳30 min，当溴酚蓝跑至分离胶时，更换至120 V电压，直至溴酚蓝跑至凝胶底部，结束电泳。采用湿转法将蛋白电泳产物转印至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭2～3 h，分别加入p-β-actin(稀释比1∶2 000)、p-AKT(稀释比1∶200)、p-NF-κB(稀释比1∶1 000)一抗，4 ℃孵育过夜。次日，加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗(稀释比1∶2 000)，室温孵育2 h。最后ECL发光，暗室中曝光、显影，实时荧光检测系统拍照。采用Image-Pro Plus6.0软件分析各蛋白电泳条带灰度值。以β-actin为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 各组移植不同时间腹水量和血清淀粉酶、TNF-α水平比较 假手术组移植6、12、24 h腹水色清、量少，血清淀粉酶、TNF-α水平变化不明显。模型组移植6 h即有大量红褐色腹水，随着移植时间延长逐渐增多，血清淀粉酶、TNF-α水平在移植24 h内先升高后降低。移植组移植6、12、24 h腹水量较模型组同期均降低，但差异均无统计学意义；而血清淀粉酶、TNF-α水平较模型组同期均明显降低(P均<0.05)。见表1。

2.2 各组胰头组织形态学观察 假手术组胰腺组织结构清晰，大部分腺泡小叶完整，无明显炎性细胞浸润，未见间质充血、出血和腺泡细胞坏死；随着时间推移，胰腺组织和细胞并未见明显改变。模型组胰腺组织结构不清，腺泡小叶结构破坏，组织间隙水解消失，小叶间水肿，胰腺细胞无法辨认，伴有大量炎性细胞浸润，并有明显出血灶和坏死灶；随着时间推移，胰腺组织水解、细胞坏死及炎性细胞浸润逐渐加重。移植组胰腺组织结构尚清晰，组织间隔清楚，胰腺细胞肿胀，伴有少量炎性细胞浸润，偶见点状出血，未见腺泡细胞坏死。随着时间推移，胰腺组织水解、炎性细胞浸润进一步加重，但仍可见其基本结构。

表1 各组不同时间腹水量和血清淀粉酶、TNF-α水平比较

注：与假手术组同期比较，*P<0.05；与模型组同期比较，#P<0.05。

2.3 各组胰腺组织p-AKT、p-NF-κB mRNA与蛋白表达比较 见表2。

表2 各组胰腺组织p-AKT、p-NF-κB mRNA与蛋白相对表达量比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3 讨论

随着对SAP发病机制的深入研究和临床救治水平的提高，其病死率得到明显控制，已降至10%左右[9，10]。目前关于SAP具体的发病机制尚不完全清楚，比较公认的是“二次打击”学说。所谓“二次打击”就是急性胰腺炎早期，胰腺组织损伤后释放大量炎性因子，如TNF-α、IL-6、IL-1β等，在血液循环中形成第一次高峰，这些炎性介质可导致肠黏膜屏障功能障碍，进而引起肠道菌群易位，形成内毒素血症，从而导致胰腺组织继发感染、炎性因子瀑布式激活、炎性细胞浸润，造成胰腺组织水肿、出血和坏死，进一步发展为全身炎性反应综合症和多器官功能衰竭[11]。而NF-κB作为这一机制的“扳机点”，其作用更是不可小觑[12,13]。NF-κB是一种多向性核转录因子调节蛋白，作为SAP发病机制的核心环节之一，一方面NF-κB激活可上调细胞内P-选择素、细胞间黏附因子1表达，从而使多形核中性粒细胞趋化而贴壁和渗出，进而导致胰腺组织水肿与炎性细胞浸润[11]；另一方面NF-κB激活后，迅速入核与特定的基因启动子或增强子结合，从而上调其细胞因子和炎性因子基因转录与表达，导致血清TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性介质水平明显升高，进而造成“炎症瀑布”[14]。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号转导通路是介导细胞外信号引起细胞反应的重要信号调控系统，可参与机体多种病理生理过程，如肿瘤形成、应激反应、炎性反应等。有研究发现，抑制PI3K/AKT信号转导通路可明显减轻脓毒血症、长期机械通气所引起的炎性反应[15,16]；而且PI3K/AKT信号转导通路能够介导SAP大鼠中性粒细胞活化及炎性因子TNF-α、IL-1β生成[17]。目前认为，作为PI3K下游靶蛋白的AKT活化后，可使抑制蛋白IκBa磷酸化，继而激活NF-κB[18，19]。这些理论为SAP治疗提供了新的方向。

干细胞移植作为当今社会新兴的再生医疗技术，在治疗神经系统、免疫系统等疾病方面较传统治疗方法具有不可比拟的效果。根据干细胞来源不同，可分为BMSCs、ADSCs、胰腺干细胞等。针对SAP治疗，最理想的是胰腺干细胞，但由于其数量少、提纯困难等因素，无法满足临床治疗需要。已有研究证实，BMSCs、ADSCs亦能定向分化为胰腺细胞[20，21]。但BMSCs来源匮乏，不适合治疗性研究。ADSCs的作用效果与BMSCs相似，而且组织相容性复合体Ⅰ低表达，可逃避免疫系统识别，无需配型[4]。此外，脂肪组织来源广泛，ADSCs取材容易[5]。本课题组前期研究证实，人ADSCs经大鼠尾静脉注射，可定向迁移至胰腺组织，发挥相应的修复或治疗作用。但目前对ADSCs治疗SAP的具体作用机制尚不清楚。

本课题组前期研究发现，人ADSCs经SAP大鼠尾静脉注射，可抑制体内TNF-α、IL-6、IL-10等炎性因子释放[22～24]。本研究结果发现，随着移植时间延长，移植组和模型组腹水量较假手术组均逐渐增多，虽然移植组各时间腹水量均低于模型组，但差异无统计学意义；移植组和模型组各时间血清淀粉酶、TNF-α水平均明显高于对照组，但移植组血清淀粉酶、TNF-α水平较模型组同期均明显降低；移植组胰头组织水肿、坏死及炎性细胞浸润情况均较模型组轻微。结果表明人ADSCs移植对大鼠SAP具有一定治疗作用。进一步研究发现，模型组p-AKT、p-NF-κB mRNA与蛋白相对表达量均明显高于假手术组，而移植组p-AKT、p-NF-κB mRNA与蛋白相对表达量均明显低于模型组。表明人ADSCs可能是通过抑制AKT磷酸化进而抑制NF-κB激活，产生弱化“二次打击”扳机点作用，而且这种作用在炎症早期较为明显，随着炎症时间推移逐渐减弱。这为SAP早期ADSCs移植治疗奠定了基础。

综上所述，人ADSCs移植对大鼠SAP具有一定治疗作用，其作用机制可能与抑制AKT磷酸化进而抑制NF-κB激活，继而产生弱化“二次打击”扳机点作用有关。但本研究尚有许多不足之处，如各指标观察时间过长、炎症因子TNF-α释放减少的分子机制是抑制AKT磷酸化的证据相对不足等，这些问题有待于今后进一步研究论证。