Box-Behnken结合响应面法优化制备氟尿嘧啶长循环热敏脂质体

吴义来，汪魏平，徐文科

氟尿嘧啶（Fluorouracil，FU）作为经典的抗肿瘤药，其抗瘤谱广，对消化道肿瘤、乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、绒毛膜上皮癌和皮肤癌等均有一定疗效.临床上，FU单独使用或与其他药物联合应用于乳腺癌和胃肠道肿瘤手术后的辅助治疗［1］.但是，FU脂溶性小，口服吸收不规则，生物利用度低，故一般采用静脉给药.持续输液可较长时间在机体中维持有效血药浓度，临床效果优于静脉推注，但较长时间的输液降低了患者的依从性和顺应性.另外，FU严重的骨髓抑制和消化道毒性等强烈的毒副作用发生率较高，这些缺点都极大限制了其临床应用［2-3］.

脂质体是一种由磷脂或其他辅助成分分散于水相中有序排列形成的单层或多层囊泡，其磷脂双分子层结构类似生物膜，故相容性较好［4］.本研究拟采用经典的热敏长循环处方：二棕榈酰基卵磷脂（Dipalmitoyl phosphatidylcholine，DPPC）、单链溶血磷脂（Mono-stearoyl phosphatidylcholine，MSPC）和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙 二 醇 2000（Distearoyl phosphoethanolamine-PEG2000，DSPE-PEG2000）制备氟尿嘧啶长循环热敏脂质体（Fluorouracil loaded Long-circulating thermo-sensitive liposomes，FU-LCTSLs），利 用Box-Behnken结合响应面法优化各成分比例，制备包封率较高、稳定性较好的FU-LCTSLs，为后续的药效学实验奠定基础.

1 材料

1.1 药品与试剂

FU（美国Sigma公司，纯度＞99%）；DPPC（日本NFC公司，纯度99.5%）；MSPC（日本NFC公司，纯度97.2%）；DSPE-PEG2000（日本NFC公司，纯度99.86%）；NaCl（天津德恩化工试剂有限公司）；KCl（天津博迪化工股份有限公司）；Na2HPO4·12H2O（天津天力化工试剂有限公司）；KH2PO4（天津化工试剂三厂）；浓盐酸（武汉中天化工有限责任公司）；甲醇（色谱纯，德国默克）；无水乙醇（分析纯，天津德恩试剂有限公司）；超纯水（实验室自制）.

1.2 仪器与耗材

高效液相色谱系统（含Waters 2707自动进样器、Waters 1525二元泵、Waters 2998二极管阵列检测器及BreezeTM2操作系统，美国Waters公司）；微型脂质体挤出器（Avestin，加拿大）；高速离心机（ThermoFisher，美国）；分析天平（FA1004型电子天平，上海天平仪器厂）；精密天平（AUW220D型电子天平，日本岛津公司）；超声清洗仪（SK-8200HP型，上海科导超声仪器有限公司；真空泵（SHB-Ⅲ循环水式泵，郑州长城有限公司）；纯水制备仪（优普超纯水机，成都超纯科技有限公司）；精密pH计（pHS-3B型，上海精科雷磁科学仪器有限公司）；普通冰箱（BCD-216T XZ型冰箱，青岛海尔有限公司）.

2 方法与结果

2.1 FU-LCTSLs制备

按处方量分别称取DPPC、MSPC及DSPEPEG2000（DPPC∶ MSPC∶ DSPE- PEG2000=86∶10∶4，摩尔比），溶于氯仿/乙醚混合液（1∶2，V/V），置于500 mL茄形瓶中.将FU溶于pH=4.0的柠檬酸缓冲溶液中，缓慢加入茄形瓶中，涡旋3 min混合有机相和水相，水浴超声至形成均一稳定的W/O型乳状液（静置30 s不分层）.55℃减压旋蒸除去有机溶剂，使乳液在瓶壁上形成凝胶，继续旋蒸至凝胶脱落，得到均匀的脂质体混悬液.用1 mol/L磷酸氢二钠溶液将pH调至7.4，以pH=7.4磷酸盐缓冲溶液调至适当浓度后，55℃水浴保温15 min.所得脂质体混悬液25℃水浴超声10 min后挤压通过100 nm聚碳酸酯膜，得到粒径约100 nm的脂质体.

2.2 FU含量测定方法学建立

（1）色谱条件.色谱柱：Thermo Hypersil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（35∶65，V/V）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：265 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL.

（2）专属性试验.取0.4 mL空白脂质体、FU脂质体分别以0.4 mL甲醇破乳后进样10 μL，按2.2（1）所述色谱条件分析，记录色谱图.FU保留时间在4.5 min左右，峰型良好，空白脂质体以及破乳剂甲醇对FU的含量测定无干扰.

（3）标准曲线的建立.称取FU对照品12.03mg，以流动相溶解，定容至25 mL，所得标准品溶液浓度为481.20 μg/mL，作为母液，4℃避光保存备用.精密吸取母液，稀释成浓度为481.20 μg/mL、240.60 μg/mL、60.15 μg/mL、30.08 μg/mL、15.04 μg/mL、7.52 μg/mL系列标准溶液.精密吸取系列标准溶液各进样10 μL，按2.2（1）所述色谱条件分析，记录色谱图和峰面积，以标准溶液浓度c为横坐标，FU峰面积响应值A为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程A=32740c+14 670，相关系数r=0.9998.结果显示，在7.52～481.20μg/mL范围内，峰面积与浓度线性关系良好.

（4）精密度试验.日内精密度：取制备好的FU脂质体，按样品处理方法制备6批样品，连续进样，记录峰面积，计算RSD%；日间精密度：取制备好的同一批FU脂质体，按样品处理方法处理后，连续6天进样，记录峰面积，计算RSD%.日内精密度和日间精密度试验RSD%分别为1.19%、1.10%，说明该检测方法精密度良好.

（5）回收率试验.取9支EP管，各加入0.4 mL空白脂质体，分别加低浓度（15.04 μg/mL）、中浓度（240.60 μg/mL）、高浓度（481.20 μg/mL）FU对照品溶液各0.8 mL，每浓度各加三支EP管，加0.4 mL甲醇，涡旋破膜，进样测定，计算回收率，低、中、高浓度样品平均加样回收率分别为97.52%、99.54%和99.13%，符合方法学要求.

（6）包封率测定方法.本实验采用超滤离心法分离游离药物.精密吸取0.4 mL已制备的载药脂质体于超滤管内，将超滤管套入剪去管帽的EP管中，8 000 rpm离心30 min，向超滤管中加0.4 mL的PBS，继续离心30 min，收集EP管中滤液，进样分析，测定游离药物含量；另取0.4 mL载药脂质体0.4 mL甲醇破乳后，进样分析，测定药物总含量，按下式计算包封率.

包封率（EE）%=脂质体包封的药物量/（脂质体包封药物量+游离药物量）×100%.

2.3 处方优化

本实验利用Design Expert软件实现Box-Behnken实验设计法结合响应面法（BBD-RSM），以脂质体的包封率为响应值Y（%），选取对脂质体包封率影响较为显著的3个因素，分别记作X1（磷脂与FU质量比）、X2（水化液FU浓度），X3（有机相与水相体积比），在-1、0、+1三个水平上进行优化研究，建立多元二次回归方程数学模型［5-6］.各因素水平见表1，建立的Box-Benhnken实验设计及结果如表2所示.

表1 Box-Behnken实验设计的因素和水平

2.3.1 二次回归方程的建立

对表2中的数据进行多元二次回归分析，得到X1、X2、X3与Y的二次多项回归方程

对该模型进行显著性检验，回归模型方差分析结果见表3.

表2 Box-Behnken设计与试验结果

表3 包封率回归模型方差分析

由方差分析结果可知，模型F值=42.20，P＜0.000 1，表明模型极显著；P＜0.05的模型项显著，所以本试验中X1、X2、X3、X1X3、、对Y的影响极显著，其他项对Y的影响不显著.故上述多元二次回归模型可优化为

模型的概率P＜0.000 1，表明模型极显著；同时，方程的失拟项F值为2.75，概率P＞0.05，失拟项不显著，说明该回归方程在整个回归区域的拟合情况良好，可以用该模型准确模拟X1（磷脂与FU质量比）、X2（水化液FU浓度），X3（有机相与水相体积比）对Y（包封率%）的影响［7］.

2.3.2 效应面优化和预测

利用Design-Expert软件分别固定X1（磷脂与FU质量比）、X2（水化液FU浓度），X3（有机相与水相体积比）三个影响因素其中之一，分析其他两个因素对响应值Y（包封率%）的影响，绘制得到不同影响因素对于响应值的三维曲线图和二维等高线，见图1.

根据BBD-RSM试验结果，得到优化条件为：脂质体膜材与氟尿嘧啶的质量比为9.2∶1，水化液中氟尿嘧啶的浓度为10 mg·mL-1，有机相与水相的体积比为7∶1.

图1 各因素对包封率Y的3D响应面图和等高线图

表4 验证及重现性实验结果

根据上述优化条件，制备3批最优处方样品并分别测定包封率，以检验BBD-RSM试验所得结果的可靠性.按BBD-RSM试验所得最优处方包封率的理论值为41.26%，而3批样品实测包封率的平均值为40.85%，RSD为1.93%，说明此模型可靠，预测准确.

由以上结果可以看出，该处方工艺重现性良好，制备的脂质体粒径符合要求，包封率稳定，适用于制备FU-LCTSLs.

2.4 理化性质研究

对经优化后的FU-LCTSLs理化性质进行考察，主要包括粒径分布、Zeta电位、pH值以及热敏特性考察.

2.4.1 粒径分布和Zeta电位

取制备好的FU-LCTSLs于EP管中，PBS稀释10倍，混合均匀后加入比色皿，检测FU-LCTSLs样品的粒径和Zeta电位.每个样品平行测定3次.

同一份样品平行测定所得粒径结果精密度良好，平均粒径113.7±8.7 nm，PDI=0.538±0.072.粒径结果表明，FU-LCTSLs粒径大部分分布在110 nm左右，且粒径较规整均一.平均Zeta电位为-15.34±4.26 mV.

2.4.2 pH值

磷脂通常在中性条件下较稳定，为了保证脂质体在储存过程中的稳定性，减少磷脂的水解，脂质体制备过程最后将其pH调节到7.4，并且以pH=7.4的PBS缓冲液稀释，维持较稳定的中性pH环境.制备好的FU-LCTSLs溶液以pH计测得的pH值为7.35±0.04（n=3）.符合脂质体保存的pH条件要求.

2.4.3 热敏性评价

热敏性好坏是评价热敏脂质体制备成功与否的关键因素之一.成功的热敏脂质体在正常体温单位内保持不释药，当到达正接收热疗的肿瘤靶部位，热疗温度使热敏脂质体膜从紧密有序的胶晶态转变为紊乱松散的液晶态，脂质体内部包载的抗肿瘤药物大量释放，从而迅速达到治疗浓度.

本研究中，我们以水浴法结合超滤离心法分别考察FU-LCTSLs在正常体温37℃至热疗温度42℃间不同温度环境下的释药行为，用以评价制备得到的FU-LCTSLs热敏性.

（1）温度依赖的热敏释放行为.取6支玻璃试管，分别加入等量适量的14102001批次脂质体，6支试管做标记后分别放入37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃水浴锅中，加热8 min后立即取出试管，冰浴冷却，超滤离心法测定游离药物浓度，计算释药率.结果如图2.

图2 不同温度下FU-LCTSLs释药率直方图

由图2可知，FU-LCTSLs对温度变化较为敏感，当水浴温度低于40℃时，8 min释药率不超过20%，而当温度达40℃时释药开始加快，42℃时8 min释药率达96.49%，包封FU近乎完全释放.FU-LCTSLs表现出良好的温度敏感性.

（2）时间依赖的热敏释放行为.取2支玻璃试管，分别加入等量适量的14102001批次脂质体，pH=7.4的PBS稀释4倍，试管做好标记后分别放入37℃、42℃水浴锅中温育，分别在1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、8 min、15 min、30 min取0.4 mL脂质体悬浮液置EP管中（同时用0.4 mL等温的PBS补液），冰浴冷却，超滤离心法测定游离药物浓度，计算释药率，绘制时间-释药率曲线，结果如图3.

图3 FU-LCTSLs在37℃和42℃水浴条件中的释药曲线

由图3可知，37℃水浴30 min FU释药率仅4.32%，而在42℃水浴条件下，8 min时药物几乎全部释放.采用Origin对FU-LCTSLs在42℃下的释放曲线进行拟合，结果见表5.

表5 42℃FU-LCTSLs释放曲线动力学拟合结果

体外释放模型相关性从高到低依次为：一级＞Higuchi＞零级，说明FU-LCTSLs在42 ℃条件下的释放最优拟合为一级释放模型.

2.5 稳定性考察

2.5.1 过滤稳定性

动物试验所用脂质体必须无菌无热原，通常脂质体产品要求在无菌环境下制备，结束后需要进行过滤除菌.过滤除菌法又称微孔过滤法，微孔滤膜的孔径为0.22 μm，可有效滤除制剂中大小为0.3 μm以上的大部分细菌，适用于工业生产中的脂质体除菌.过滤稳定性试验对过滤前后脂质体的漏药率进行评价，从而评估过滤除菌的可行性.

取两支一次性注射器针筒，在超净工作台中将其套上已灭菌的0.22 μm滤头，分别取14102001批FU-LCTSLs溶液和5倍稀释液于注射器中，轻推注射器过滤，将滤液注入已灭菌的西林瓶中，取过滤后的脂质体溶液测定漏药率，结果如表6.

其中，W前为脂质体过滤前包封的药物浓度；W后为脂质体经过滤除菌后包封的药物浓度.

表6 过滤稳定性结果

由试验结果可知，FU-LCTSLs溶液原液过滤后包封率有所下降，而稀释液包封率基本不变.可能是因为原液中脂质体浓度较高，通过滤孔时发生相互挤压的机率和频率较大，脂质体本身产生一定程度的破碎，继而融合，使得药物略有渗漏.稀释液中脂质体浓度相对较低，通过滤孔时发生挤压的频率次数较少，所以包封率基本没有发生变化，过滤稳定性良好.

2.5.2 稀释稳定性

取FU-LCTSLs加入至两个西林瓶中，分别加入5%葡萄糖溶液和注射用水稀释20倍，室温放置6 h，测定漏药率，平行测定三次，结果如表7.

表7 稀释稳定性结果（%）

由试验结果可知，以5%葡萄糖溶液和注射用水稀释FU-LCTSLs，包封率均未发生显著变化，说明FU-LCTSLs的稀释稳定性较好.

2.5.3 贮藏稳定性

取FU-LCTSLs于西林瓶中，分别置于4℃冰箱和25℃室温避光保存，于第5天和第10天取出，检测脂质体漏药率，结果见表8.

表8 不同温度稳定性结果

由试验结果可知，FU-LCTSLs室温避光放置漏药率较高，而4℃避光冷藏则相对稳定，因而将FU-LCTSLs贮藏方式确定为4℃避光冷藏.

2.5.4 放样稳定性

取FU-LCTSLs于西林瓶中，放入4℃冰箱内，于0月、1月、2月、3月和6月取样检测脂质体漏药率，结果见表9.

表9 FU-LCTSLs 4℃放样6个月漏药率结果

由试验结果可知，FU-LCTSLs在4℃贮藏条件下保存6个月漏药率仍保持在较低水平，理化性质基本保持稳定.

3 讨论

本实验中，确定FU-LCTSLs采用文献中经典热敏长循环处方：DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000=86∶10∶4（摩尔比）.DPPC相变温度41℃，在人体能够耐受的局部加热温度范围内是最常用的热敏脂质体膜材.处方中加入少量水溶性单链磷脂MSPC，在温度达DPPC相变温度时，MSPC可尾部相互聚集，头部在脂质体表面形成释药小孔，加速药物从内部释放到肿瘤热疗部位.另外，DSPE-PEG2000掺入脂质体后，亲水PEG2000链在脂质体表面形成致密的构象云，避免脂质体迅速被MPS识别并吞噬，从而显著延长脂质体在体内循环中的滞留时间，利用EPR效应，这些长循环脂质体会相对多地靶向到肿瘤部位.

制备脂质体时，主动载药法制备的脂质体包封率较大，性质较稳定，不易发生药物的泄漏，本文将主动载药法与被动载药法相结合，即pH梯度法结合逆相蒸发法，制备大单室脂质体，有利于亲水性药物FU的包封，而pH梯度法极大地提高了包封率.经优化后的FU-LCTSLs外观半透明而带蓝色乳光，平均粒径113.7±8.7 nm，PDI=0.538±0.072，表明FU-LCTSLs粒径大部分分布在110 nm左右，且粒径较规整均一；平均Zeta电位-15.34±4.26 mV，在胶态体系中能较长时间保持稳定，不聚集.脂质体溶液的pH值为7.35±0.04（n=3），符合脂质体储存的pH要求.FULCTSLs对温度变化较为敏感，当水浴温度低于40℃时，8 min释药率不超过20%，而当温度达40℃时释药开始加快，42℃时8 min释药率达96.49%，包封FU近乎完全释放.FU-LCTSLs表现出良好的温度敏感性提示FU-LCTSLs在正常血液循环内会保持不释药，当利用EPR富集到正接收热疗的肿瘤靶部位时，脂质体内部包载的抗肿瘤药物会大量释放，迅速达到治疗浓度，从而实现增效减毒的作用.

Box-Behnken设计具有预测性好、结果直观、操作简单的特点，能以最少的实验次数更快更高效地优化工艺参数，目前在药物处方筛选方面已得到非常广泛的应用［8-9］.本试验运用Box-Behnken结合响应曲面法优选脂质体制备处方，极大地减少了工作量，成功地构建X1（磷脂与FU质量比）、X2（水化液FU浓度），X3（有机相与水相体积比）对包封率影响的模型，并直观地预测了最优处方.按所得优化条件制备3批样品分别测定其包封率，进行验证实验，模型预测最优处方脂质体包封率理论值为41.26%，实测包封率的平均值为40.85%，偏差为0.41%，说明此模型的预测准确可靠.处方工艺重现性良好，制备的脂质体粒径符合要求，包封率稳定，适合用于制备FU-LCTSLs.

稳定性试验包括对过滤稳定性、稀释稳定性、贮藏稳定性和长期放样稳定性等的考察，结果显示，FU-LCTSLs可成功通过过滤灭菌而不发生较多FU泄漏，与5%葡萄糖注射液和灭菌注射用水混合稀释至20倍渗漏率在可接受范围.贮藏稳定性实验提示，FU-LCTSLs的短期贮藏应保持在4℃冷藏室中.长期放样实验显示，FU-LCTSLs混悬液渗漏率随时间延长而加快，如想长期放置仍需考察冻干后保存的渗漏率变化.