全基因组分析杨树WOX基因家族在茎部发育中的作用

王 爽 张 洋 任梦轩 刘莹莹 魏志刚

(林木遗传育种国家重点实验室，东北林业大学，哈尔滨 150040)

毛果杨(Populustrichocarp)基因组测序的完成，开启了树木与环境互作响应的系统生物学研究大门。毛果杨的19条染色体含有4亿8千5百万个DNA碱基对，是拟南芥的4倍[1]。预测杨树编码基因有4万5千5百个，其中大部分基因已被克隆。毛果杨已经发展为研究树木生物学、比较基因组学和环境互作组学系统的模式物种[1～2]。

WUSCHEL-related homeobox(WOX)基因家族是植物特有的转录因子家族。WOX基因家族蛋白的保守结构域是含有60个氨基酸的同源异型域(homeobox domain，HD)，而这些氨基酸能形成“螺旋—环—螺旋—转角—螺旋”结构，并与特定的DNA序列结合，如：CAAT-box、TATA-box、CTCC片段和TATTGTAGAC片段[3]。WUSCHEL(WUS)也属于WOX基因家族，具有HD结构。根据系统发育分析将拟南芥的WOX基因家族分为三大分支。第一大分支是现代进化分支，包括WUS和AtWOX1-7；第二大分支是中间分支，包括AtWOX8、AtWOX9、AtWOX11和AtWOX12；第三大分支是远古分支，包括AtWOX10、AtWOX13和AtWOX14[3]。研究发现，AtWUS和AtWOX5基因分别在茎尖和根尖分生组织中表达，参与维持分生组织细胞功能[4～6]，且AtWUS和AtWOX5在根干细胞调节中的功能可以相互交替[5]。AtWOX4和AtWOX14冗余调控维管分生组织的分化，并对维管束和干细胞维持起到重要作用[7]。AtWOX6会干扰原基从分生组织分化，终止原基的分化[8～9]。AtWOX11和AtWOX12在根部形成层中诱导表达，促进不定根的发生[10]。AtWOX13促进果实发育过程中胚座的形成[11]。这些研究表明WOX基因家族与植物的初生和次生物质代谢、胚胎发育及细胞信号转导等生物学过程紧密相关。

已有文章对拟南芥、水稻和小桐子等WOX基因家族的表达模式、蛋白结构和亲缘关系进行了研究[3,12～14]，而对毛果杨WOX基因家族的相关研究尚未有报道。本研究利用毛果杨最新的基因组数据(Populustrichocarpav3.0)，从全基因组范围鉴定了毛果杨WOX基因家族并对其蛋白结构、保守结构域、亲缘关系、染色体定位和茎部发育表达模式进行分析，为进一步研究WOX基因家族在毛果杨茎部发育中的作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

野生型毛果杨在林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)温室中长日照培养，室内温度25±2℃。生长三个月后，分别取其初生阶段(1～2茎节)、过渡阶段(3～4茎节)和次生阶段(5～8茎节)的茎部液氮速冻，提取RNA样品，进行转录组测序和qRT-PCR验证等实验，每个样品3次生物学重复。

1.2 石蜡切片及观察

取三个月大的毛果杨茎部固定于FAA固定液中，通过包埋、切片和脱蜡，分别用甲苯胺蓝、间苯三酚和Calcofuor White Sain染液对切片进行染色，拍照观察。

1.3 毛果杨WOX基因家族的分类和分析

从植物转录因子数据库(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)中分别获得了15个拟南芥和18个杨树WOX基因的氨基酸序列；利用北京大学转录因子数据库(PlantTFDB-Plant Transcription Factor Database@CBI,PKU)获得杨树WOX基因家族的分子量和等电点数据；利用Phytozome数据库(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)获得染色体位置和各组织表达量数据。利用MEGA6.0软件中的Neighbor joining的方法构建系统发育树。利用BioEdit软件进行多序列比对，来确定这些搜索到的WOX基因家族是否具有完整的HD结构域。MEME(http://meme.nbcr.net/meme/)在线软件被用于分析毛果杨WOX蛋白的保守基序。

1.4 毛果杨WOX基因qRT-PCR分析

利用2-△△Ct分析方法对毛果杨表达谱测序结果进行qRT-PCR验证，每个样品3次生物学重复，相关定量引物见表1。

表1 qRT-PCR的引物

图1 毛果杨早期发育茎节的解剖和组织化学染色 A.温室中生长3个月毛果杨取材示意图；B、E和H.第2茎节横切面图；C、F和I.第4茎节横切面图；D、G和J.第8茎节横切面图；B、C和D.甲苯胺蓝染色；E、F和G.间苯三酚染色；H、I和J.Calcofluor White Sain的染色Fig.1 Anatomical and histochemical analyses of the successive internodes of the P.trichocarpa early developing stem A. Three months old Populus trees grown in the greenhouse as plant material schematic for this study; B,E and H. The second internode cross section; C,F and J. The fourth internode cross section; D,G and I. The eighth internode cross section; B,C and D. Toluidine blue stains; E,F and G. Phloroglucinol stain; H,I and J. Calcofluor white-stained

基因号Gene ID基因名字Gene name基因的位置Genomic position长度Length(aa)分子量MW(kDa)等电点plCDs长度Length of CDS(bp)Potri.001G237900.1PtrWOX1.1Chr01:24918823..2492023024527.888.35738Potri.002G008800.1PtrWOX2.1Chr02:484202..48634521524.485.33648Potri.002G124100.1PtrWOX2.2Chr02:9309765..931132021324.429.15642Potri.004G051600.1PtrWOX4.1Chr04:4008260..401029739043.089.11173Potri.005G101800.1PtrWOX5.1Chr05:7788135..779095824827.995.51747Potri.005G114700.1PtrWOX5.2Chr05:8858336..885998026430.046.33795Potri.005G252800.1PtrWOX5.3Chr05:25454469..2545650721624.645.73651Potri.007G012100.1PtrWOX7.1Chr07:958955..96028726429.286.43795Potri.008G065400.1PtrWOX8.1Chr08:3963469..396410418121.018.99546Potri.009G029200.1PtrWOX9.1Chr09:3976470..397782324627.616.75741Potri.010G111400.1PtrWOX10.1Chr10:13009243..1301095031635.718.31951Potri.010G192100.1PtrWOX10.2Chr10:18688337..1868905017119.626.96516Potri.011G061400.1PtrWOX11.1Chr11:5466036..546841737741.617.751134Potri.012G047700.1PtrWOX12.1Chr12:4446344..444908838743.975.621164Potri.013G066900.1PtrWOX13.1Chr13:5239050..524069225528.095.69768Potri.014G025300.1PtrWOX14.1Chr14:2169818..217137921324.479.03642Potri.015G039100.1PtrWOX15.1Chr15:3566414..356921737442.336.611125Potri.019G040800.1PtrWOX19.1Chr19:4693429..469523822625.016.16681

2 结果分析

2.1 毛果杨早期茎部发育及组织化学染色

为了研究毛果杨茎部发育过程中的变化，通过形态学和组织化学染色分析，将毛果杨茎部发育分为三个典型阶段，即，初生阶段(第1～2茎节)、过渡阶段(第3～4茎节)和次生阶段(第5～8茎节)[15]。因此，分别选择第2、4和8茎节代表三个不同的发育阶段(图1)。在第2茎节中，仅有初生生长，通过甲苯胺蓝染色、间苯三酚染色和Calcofluor White Sain染色发现，原始细胞形成的维管束仅有初生木质部和初生韧皮部(图1:B、E和H)；在第4茎节中，出现了少量的次生生长(图1:C)，初生和次生木质部均被染成红色(图1:F)，初生和次生韧皮部为蓝色(图1:I)；在第8茎节中，次生生长明显增强(图1:D、G和J)。

2.2 毛果杨WOX基因家族概况

利用已经鉴定出的15个AtWOX基因，通过Plant TFDB基因数据库查找到同源的18个PtrWOX基因。基于PtrWOX基因在染色体上的位置分布，将18个PtrWOX基因分别命名为PtrWOX1.1-PtrWOX19.1。PtrWOX基因对应的编码序列长度从516 bp(PtrWOX10.2)到1 173 bp(PtrWOX4.1)，蛋白质分子量的大小从19.62～43.97 kDa(表2)。

2.3 拟南芥和毛果杨WOX基因家族的系统进化树分析

利用MEGA6.0软件中的Neighbor joining法对拟南芥和毛果杨WOX基因家族进行系统进化树分析(图2)。根据AtWOX和PtrWOX基因家族的蛋白序列，分别将15个AtWOX和18个PtrWOX基因分为3个分支，即Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。在Ⅰ分支中，PtrWOX5.2、PtrWOX7.1和AtWUS1在同一个进化分枝上，说明同属WUS基因亚家族；PtrWOX8.1和PtrWOX10.2在同一个小分支上，亲缘关系较近；PtrWOX12.1和PtrWOX15.1同属于一个小分支亲缘关系比较近；PtrWOX1.1、PtrWOX9.1和AtWOX2亲缘关系较近，推断表达模式可能相近；PtrWOX2.2和PtrWOX14.1与AtWOX4亲缘关系近，推断可能和茎部发育有关；PtrWOX4.1、PtrWOX11.1、PtrWOX13.1和PtrWOX19.1同属于Ⅱ分支，亲缘关系较近；PtrWOX2.1、PtrWOX5.1和PtrWOX5.3同属于Ⅲ分支，亲缘关系同样较近。

图2 拟南芥与毛果杨WOX基因家族的系统进化树Fig.2 The phylogenetic tree of WOX gene families in Arabidopsis and P.trichocarpa

2.4 毛果杨WOX家族基因保守基序分析

通过MEME和BioEdit软件分别对18个PtrWOX基因的保守基序和蛋白结构域进行了分析(图3～4)。如图3所示，多个独立的保守基序被鉴定，命名为基序1-10。其中基序1和2为HD结构，存在于所有的PtrWOX基因中；基序4为WUS-box基序(TLXLTP)，存在于组Ⅰ所有PtrWOX基因中；组Ⅱ中都存在基序10；组Ⅲ都存在基序9。而PtrWOX基因家族的蛋白序列均包含一个高度保守的“螺旋—环—螺旋—转角—螺旋”结构域(图4A),仅有7个PtrWOX基因家族的蛋白序列含有WUS-box基序(图4B)。结果表明，鉴定出的18个PtrWOX基因均为WOX基因家族成员，进一步支持了系统进化树分析结果，且同一分支中的基因可能具有相似的功能。

图3 毛果杨WOX基因蛋白保守基序分析Fig.3 Analysis of the conserved motif of WOX genes proteins in P.trichocarpa

图4 毛果杨WOX基因蛋白序列保守结构域分析 A.WOX蛋白螺旋—环—螺旋—转角—螺旋结构域分析；B.WOX蛋白WUS-box基序分析Fig.4 Conserved domain analysis of WOX genes protein sequences in P.trichocarpa A.The analysis of WOX proteins helix-loop-helix-turn-helix-helix domain; B.WOX protein WUS-box motif analysis

2.5 毛果杨WOX基因家族的基因结构分析

利用PtrWOX基因家族的CDs序列分析基因结构(图5)。结果表明，外显子和内含子结构在该基因家族中存在差异，内含子数量从1到4不等，亲缘关系较近的基因中含有大致相同数量的内含子。例如，在Ⅲ分支中，除了PtrWOX13.1含有2个内含子外，其他成员均包含4个内含子；Ⅱ分支中的PtrWOX2.1和PtrWOX5.1都有一个内含子；PtrWOX10.1和PtrWOX15.1属同一分支，都有四个内含子；然而PtrWOX12.1只有一个内含子，但同源的PtrWOX15.1中却有3个内含子。结果进一步支持了系统进化树中PtrWOX基因分类，同一分支中的基因可能具有相似的功能。

2.6 毛果杨WOX基因家族基因染色体定位分析

基于phytozome网站数据，对18个PtrWOX基因进行了染色体定位分析。结果表明，18个PtrWOX基因不均匀的分布在各条染色体上。其中1、4、7、8、9、11、12、13、14、15和19号染色体上均分布1个PtrWOX基因；2和10号染色体上均分布2个PtrWOX基因；5号染色体上分布3个PtrWOX基因；3、6、16、17和18号染色体上没有分布(图6)。18个PtrWOX基因形成了8个旁系同源基因对，且每对同源基因都不在同一染色体上。说明家族在进化过程中可能出现过基因复制事件。已有研究表明，毛果杨GT基因家族中鉴定出15个旁系同源基因对，其中14个发生了基因重复事件[16]。

图5 毛果杨WOX家族进化树及基因结构Fig.5 The phylogenetic relationships and gene structures of WOX gene family from P.trichocarpa

图6 PtrWOX基因在毛果杨染色体上的定位Fig.6 Location of PtrWOX genes in P.trichocarpa on chromosome

2.7 毛果杨WOX基因家族组织表达特异性分析

为了研究PtrWOX基因家族在毛果杨茎部生长发育的作用，分别利用MeV软件对phytozome网站中18个PtrWOX基因在各个组织中的表达量和毛果杨茎部转录组数据绘制色温图(图7)并进行分析。结果表明，18个PtrWOX基因在杨树各组织表达情况并不一致(图7A)。其中PtrWOX1.1、PtrWOX8.1、PtrWOX9.1、PtrWOX19.1基因在茎部没有表达量(图7B)；PtrWOX2.1、PtrWOX2.2、PtrWOX5.1和PtrWOX14.1在茎部的表达量比较高。为了进一步验证PtrWOX基因家族在毛果杨茎部不同发育阶段的表达情况，选取部分PtrWOX基因家族成员进行qRT-PCR验证。实验发现，qRT-PCR结果与表达谱数据变化趋势基本一致，其中PtrWOX2.1、PtrWOX2.2和PtrWOX5.1在次生茎部表达量较高，PtrWOX14.1在过渡茎部表达量最高。该结果表明，通过转录组测序获得的PtrWOX基因家族表达数据可靠。

图7 毛果杨WOX基因在茎部发育表达模式分析 A.phytozome网站预测结果；B.转录组数据结果Fig.7 The expression pattern analysis of WOX genes in stem development in P.trichocarpa A.phytozome website predicted the results; B.Transcriptome data results

图8 qRT-PCR分析Fig.8 Analysis of the qRT-PCR

3 讨论

毛果杨是木本模式植物，在2006年毛果杨全基因组测序完成，使得利用生物信息学方法分析毛果杨各基因家族成为可能。迄今为止，毛果杨中LBD、HMA、FLA、HSF、CLE等多个基因家族已经被分析鉴定[17～22]。而毛果杨WOX基因家族在茎部发育的研究尚未有报道。WOX基因家族是植物特有的一类转录因子，在拟南芥的根和花序茎发育中起着重要作用。

本研究从毛果杨基因组中鉴定出18个WOX基因家族成员(表2)，其家族成员数目与拟南芥和水稻相近，均具有高度保守的HD结构域(图4A)，少数含有特异性的WUS-box结构域(图4B)。说明WOX基因家族在进化过程中具有较高的保守性。家族进化树分析发现，共存在8个旁系同源基因对，且均分布在不同染色体上(图5)，说明该家族在进化过程中可能出现过基因复制事件；亲缘关系较近的基因中含有大致相同数量的内含子，表明进化关系相近的基因具有相似的结构。染色体定位分析说明，18个PtrWOX基因随机分布在毛果杨15条染色体上(图6)。拟南芥和毛果杨WOX基因的进化树分析结果表明，具有相似功能的WOX基因聚集在同一分枝，可为预测毛果杨WOX家族中基因的功能提供重要参考依据(图1)。AtWOX2、AtWOX3和AtWOX4对维管束形成层和原始形成层有调控作用[6～7]，PtrWOX1.1、PtrWOX2.2、PtrWOX9.1、PtrWOX10.1和PtrWOX14.1均是它们的同源基因，但研究发现PtrWOX2.2和PtrWOX14.1在茎部表达量较高(图7)，其余基因表达量低或不表达，说明PtrWOX2.2和PtrWOX14.1可能在毛果杨茎部维管束形成层中发挥功能。AtWOX13基因被证实与侧根的形成和花的生长发育相关[11]，PtrWOX5.3是与杨树木质部形成有关的重要转录因子[23]，PtrWOX2.1和PtrWOX5.1是它们的同源基因，且在毛果杨茎部表达量较高(图8)，可能与茎部发育有关。PtrWOX5.2和PtrWOX10.2分别是AtWUS和AtWOX5的同源基因，AtWUS和AtWOX5参与维持顶端分生组织细胞功能[4～6]，PtrWOX5.2和PtrWOX10.2在茎部发育各个阶段均有表达，可能参与维持茎部分生组织细胞功能。综上所述，PtrWOX基因家族中PtrWOX2.1、PtrWOX2.2、PtrWOX5.1、PtrWOX5.2、PtrWOX5.3、PtrWOX10.2和PtrWOX14.1，可能参与毛果杨的茎部发育。

为了全面了解毛果杨WOX基因家族特性，本研究对鉴定出的18个PtrWOX基因进行了染色体定位、理化性质、结构特征、进化关系以及表达模式分析，为今后进一步研究该家族基因奠定基础。