多孔淀粉负载青蒿素微球的溶出、生物利用度和组织分布研究

赵 雪 杨逢建 葛云龙 王玲玲 李汶罡 邓怡平 赵修华

(东北林业大学，哈尔滨 150040)

青蒿素是从药用植物黄花蒿(ArtemisiaannuaL.)中分离纯化的一种内含过氧桥基团的倍半萜内酯化合物[1～2]。近年来的研究发现，青蒿素及其衍生物不仅可以治疗疟疾，而且在抗肿瘤、抗病毒和免疫抑制等疾病方面也具有多种生物活性，已成为当今新型抗肿瘤药物研究领域的热点[3～5]。然而，青蒿素属脂溶性化合物，水溶性极差，生物利用度低，使其在临床中的应用和开发严重受限[6～7]。目前学者们解决这一难题，主要是通过改变青蒿素的官能团，进行糖基化和盐基化结构修饰获得一系列的衍生物，如蒿甲迷、双氢青蒿素、青蒿琥酯等[8]。新的衍生物虽然一定程度上增加了青蒿素的水溶性，但改造后的官能团对人体的毒副作用很大。本文在前期研究中，选取一种新型药物载体多孔淀粉，其由淀粉改良后具有许多微米级孔隙，可以产生巨大的吸引力，能把药物吸附到小孔中，使药物不容易脱离[9～13]。通过多孔淀粉与青蒿素原药进行负载，成功制备多孔淀粉负载青蒿素微球(ART-PS)，多孔淀粉在体内胃肠道酶的降解作用后将孔隙中的青蒿素释放，从而发挥药效，以提高青蒿素的水溶性。本研究不仅解决青蒿素原药水溶性的难题，更意在提高其生物利用度和稳定性，使青蒿素更加高效的应用于癌症的临床治疗中[14～17]。本文将进一步探讨多孔淀粉负载青蒿素微球在体外溶出实验中，相比于青蒿素原药的溶出效果以及在大鼠体内的生物利用度和组织分布规律。

1 材料和方法

1.1 材料

青蒿素分析纯标准(美国Aladdin公司，98%，批号171130)；青蒿素原药(西安通泽生物科技有限公司，98%，批号140705)；多孔淀粉(辽宁立达生物科技有限公司，玉米淀粉为原料，批号170624)；多孔淀粉负载青蒿素微球(自制)；乙腈色谱级(天津市天力化学试剂有限公司)；甲醇色谱级(天津市天力化学试剂有限公司)；去离子水(实验室自制)；盐酸(新乡市宏盛化工有限公司限公司)；磷酸二氢钾分析纯(天津市天力化学试剂有限公司)；氢氧化钠分析纯(天津市天力化学试剂有限公司)；肝素钠(湖北鑫润德化工有限公司)；玻璃毛细管(北京友诚生物科技有限公司)。

1.2 多孔淀粉负载青蒿素微球的制备工艺

多孔淀粉又称微孔淀粉，是通过机械、化学或生物方法作用于生淀粉，使其内部形成微米级孔径的一种新型辅料，具有安全、无毒、高效、生物可降解以及廉价易得等优点，是一类极具开发潜力的新型药物载体，在国内外已被广泛研发并应用于医药卫生领域[18]。多孔淀粉具有优良的吸附性能，是由于表面吸附和孔径吸附的共同作用。多孔淀粉具有许多小孔一直延伸到淀粉颗粒中心附近，形成蜂窝状的内部中空结构，可以产生巨大的吸引力，能将药物吸附到小孔中，使药物不容易脱离，而且仍保持颗粒基本形状[13～16]。多孔淀粉本身不溶于水，但由于具有较大的比表面积，因此在吸附药物后，它可以有效提高药物的溶出速度与溶出率。多孔淀粉已成功用于制备多种化学药物，如洛伐他汀[19]、卡马西平[16]，普罗布考[20]和环丙沙星[17]等。本文在前期的工作中，以青蒿素为原料，多孔淀粉为载体(订购)，制备了多孔淀粉负载青蒿素微球，并且进行了制备工艺优化、理化性质的表征和水溶性的测试。

多孔淀粉负载青蒿素微球(ART-PS)是采用物理吸附方法使多孔淀粉微粒吸附青蒿素原药，通过单因素法优化，从而确定了最佳制备工艺条件：在10 mL的丙酮反应体系中，青蒿素原药的加入浓度为80 mg·mL-1，多孔淀粉的加入量为2 560 mg，多孔淀粉吸附青蒿素的最佳吸附时间为30 min，最佳搅拌时间为2 h，反应温度为37℃。在最优条件下制备得到的多孔淀粉负载青蒿素微球的载药量为20.37%。通过扫描电镜检测(SEM)、比表面积的测定(BET)、红外光谱检测(FTIR)、X射线衍射检测(XRD)、差示扫描量热法(DSC)和热重量分析(TG)检测分别对多孔淀粉负载青蒿素微球的理化性质进行了表征分析，成功检测到青蒿素原药被负载在多孔淀粉的孔隙中形成的青蒿素微球。在比表面积(BET)的测定结果中，多孔淀粉的比表面积为5.11 m2·g-1，而多孔淀粉负载青蒿素微球的比表面积为0.12 m2·g-1，说明多孔淀粉孔隙已被青蒿素填充，使其孔隙变小，成功负载。在红外(FTIR)结果分析中，青蒿素原粉经过多孔淀粉的吸附过程，其表面化学结构没有变化，青蒿素主要被吸附于多孔淀粉内部孔径之中，在表面有少量分布。X射线衍射检测(XRD)、差示扫描量热法(DSC)和热重量分析(TG)检测结果也分别再次验证，青蒿素原药已经成功被多孔淀粉负载。多孔淀粉负载青蒿素微球的饱和溶解度显著提高，在水、人工胃液、人工肠液中分别是青蒿素原药的3.77、1.64和1.72倍。

1.3 体外释放

1.3.1 人工胃液的制备

取浓度为1 mol·mL-1的稀盐酸3.84 mL，定容至1 000 mL。调节pH值至1.2，用0.22 μm的滤膜过滤。

1.3.2 人工肠液的制备

称取磷酸二氢钾6.8 g，加入500 mL的超纯水中，使其溶解完全。称量0.4 g氢氧化钠加入100 mL的超纯水中，在三角瓶中使其完全溶解，即4 mg·mL-1的氢氧化钠溶液。调节pH值至6.8，加水定容至1 000 mL，用0.22 μm的滤膜过滤。

1.3.3 体外溶出检测

将本文前期工作中制备出的多孔淀粉负载青蒿素微球(33.07 mg)、青蒿素原药(7.88 mg)和物理混合药(原药7.88 mg、多孔淀粉25.20 mg)，分别放入200 mL水、人工胃和人工肠液中，置于恒温搅拌器内，转速40 rpm·min-1，在37℃恒温下释放。分别在0.083、0.17、0.25、0.33、0.42、0.5、0.58、0.67、0.75、0.83、0.92、1、1.17、1.33、1.5、1.67、1.83、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、24、28、32、36和48 h的时间点取样1 mL，取样后同时补回1 mL的水、人工胃液和人工肠液。样品经离心后取上清液，用0.22 μm的滤膜过滤后，用高效液相色谱仪检测青蒿素的含量。

1.4 生物利用度检测

1.4.1 青蒿素的高效液相色谱检测

液相色谱柱(品牌Diamonsil)反相C18柱(250 mm·4.6 mm，5 μmol·L-1)，柱温为30℃。流动相为乙腈和水，体积比为60∶40，流速为1.0 mL·min-1，检测波长为210 nm，进样量为10 μL，保留时间为12 min。本文通过外标法设定青蒿素标准品浓度分别为1 000、100和10 μg·mL-1，检测不同浓度下峰面积，根据检测血样的峰面积计算出血样中所含青蒿素的浓度。

1.4.2 大鼠取血

SD大鼠20只(哈尔滨医科大学第一附属医院动物中心，清洁Ⅱ级)，体重200～250 g，喂食标准颗粒词料，自由饮水。饲养环境温度为18～23℃，湿度保持在45%～70%。

挑选18只大鼠，随机分成两组，每组6只，采取灌胃方式给药，青蒿素浓度为50 mg·kg-1。在灌胃前12 h开始禁食，保证饮水充足，同时灌食青蒿素原粉和多孔淀粉负载青蒿素微球。在0.083，0.167，0.333，0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0和24.0 h时从大鼠的眼眶静脉处取血，取血量大概500 μL左右，放入装有20 μL 1%肝素钠的离心管中，轻摇使肝素钠与血液混合均匀，3 000 r·min-1的条件下离心10 min，取出上清血浆，放在4℃冰箱保存，当天处理。

1.4.3 血样处理

将血样放入带有肝素纳(1%)的1.5 mL离心管中，精确吸取血清100 μL于1.5 mL离心管中，加入3倍体积乙腈300 μL，涡旋3 min，离心(12 000 r·min-1)15 min，在50℃水浴中水解60 min，冷却后，用氮气挥干后。残渣用30 μL流动相(乙腈：水)复溶，涡旋1 min，12 000 r·min-1条件下离心15 min，取上清用0.22 μmol·L-1的滤膜过滤后，吸取10 μL经高效液相色谱仪检测，测定样品中青蒿素浓度。

1.5 组织分布检测

分别选取体重在250 g左右的大鼠共计98只，大鼠的性别为雌性。通过随机分组的方式，将98只大鼠平均分组。在实验开始的前一天，需要对大鼠进行断食，但饮水自由。灌胃前，对每组大鼠称重标记，每组6只大鼠在随机分成两小组，其中3只为灌胃青蒿素原药组，另外3只为灌胃多孔淀粉负载青蒿素微球组，灌胃的计量为250 mg·kg-1。在对大鼠灌胃后的0.5，1，2，4，6，8，12和24 h后分别迅速对大鼠进行断颈方式处死并解剖，完成对心、肝、脾、肺、肾、脑6个器官的摘取，称量后，将器官分别置于试管中，并加入适量(1 mL)蒸馏水中后进行高速匀浆。将精准吸取的100 μL的组织匀浆液加入离心管中后，再加入甲醇0.4 mL，混匀涡旋超声10 min，13 000 r·min-1离心10 min。取上层清夜20 μL，采用高效液相色谱仪分别对各组织器官中青蒿素的含量进行检测分析。

2 结果

2.1 体外溶出结果分析

图1为青蒿素原药、多孔淀粉负载青蒿素微球和物理混合物在水中的溶出曲线。多孔淀粉负载青蒿素微球在水中的释放效果较青蒿素原粉、物理混合物都有明显提高。在溶出实验开始1 h时，青蒿素原药的溶出率为11.57%，物理混合物的溶出率为12.24%，而多孔淀粉负载青蒿素微球的溶出率已经达到86.42%，分别是原药和物理混合物溶出率的7.47和7.06倍。青蒿素原药和物理混合物在水中的最终释放累积量仅有24.45%和29.17%，而多孔淀粉负载青蒿素微球在水中的最终释放累积量为98.67%，分别是原药和物理混合物的4.04和3.38倍。

图1 多孔淀粉负载青蒿素微球(a)、物理混合物(b)和青蒿素原粉(c)在水中的溶出Fig.1 Dissolution of ART-PS(a),physically-mixed drug(b) and artemisinin(c) in water

图2为青蒿素原药、多孔淀粉负载青蒿素微球和物理混合物在人工胃液中的溶出曲线。多孔淀粉负载青蒿素微球在人工胃液中的释放效果较青蒿素原粉、物理混合物都有明显提高。在溶出实验开始1 h时，青蒿素原药的溶出率为13.04%，物理混合物的溶出率为11.56%，而多孔淀粉负载青蒿素微球的溶出率已经达到84.92%，分别是原药和物理混合物溶出率的6.51和7.35倍。青蒿素原药和物理混合物在人工胃液中的最终释放累积量仅有25.72%和27.68%，而多孔淀粉负载青蒿素微球在人工胃液中的最终释放累积量为92.21%，分别是原药和物理混合物的3.59和3.33倍。

图2 多孔淀粉负载青蒿素微球(a)、物理混合物(b)和青蒿素原粉(c)在人工胃液中的溶出Fig.2 Dissolution of ART-PS(a),physically-mixed drug(b) and artemisinin(c) in artificial gastric juice

图3 多孔淀粉负载青蒿素微球(a)、物理混合物(b)和青蒿素原粉(c)在人工肠液中的溶出Fig.3 Dissolution of ART-PS(a),physically-mixed drug(b) and artemisinin(c) in artificial intestinal juice

图3为青蒿素原药、多孔淀粉负载青蒿素微球和物理混合物在人工肠液中的溶出曲线。多孔淀粉负载青蒿素微球在人工肠液中的释放效果较青蒿素原粉、物理混合物都有明显提高。在溶出实验开始1 h时，青蒿素原药的溶出率为13.37%，物理混合物的溶出率为12.02%，而多孔淀粉负载青蒿素微球的溶出率已经达到77.95%，分别是原药和物理混合物溶出率的5.83和6.49倍。青蒿素原药和物理混合物在人工肠液中的最终释放累积量仅有23.14%和26.09%，而多孔淀粉负载青蒿素微球在人工肠液中的最终释放累积量为88.41%，分别是原药和物理混合物的3.82和3.39倍。

2.2 生物利用度的研究

表1为外标法测定青蒿素标准品相应浓度下的峰面积，图4为青蒿素原药和多孔淀粉负载青蒿素微球按50 mg·kg-1浓度灌胃后，绘制的大鼠血药浓度曲线。多孔淀粉负载青蒿素微球在大鼠体内的吸收速度明显高于青蒿素原药，在大鼠灌胃后2 h左右，血药浓度达到最高值199.74 μg·mL-1，而青蒿素原药在灌胃4 h后，血药浓度才达到最高值68.77 μg·mL-1。多孔淀粉负载青蒿素微球的最高血药浓度是青蒿素原药的2.90倍。实验结果表明，在服用青蒿素含量相同的药物时，多孔淀粉负载青蒿素微球能以更快的速度在体内得到吸收和利用，因此检测到血药浓度最高。在对大鼠分别灌胃48 h后，测定血药浓度，青蒿素原药的血药浓度为1.8 μg·mL-1，基本已经检测不到青蒿素在体内的存留，远远低于多孔淀粉负载青蒿素微球原药在48 h的血药浓度61.06 μg·mL-1，此时，多孔淀粉负载青蒿素微球的血药浓度是青蒿素原药的33.92倍。

表1 青蒿素标品浓度

Table 1 Concentration of artemisinin standard substance

标品浓度Concentration(μg·mL-1)保留时间Retention time峰面积Peak area100012.48544345410012.511359401012.4554021

图4 多孔淀粉负载青蒿素微球(a)和青蒿素原粉(b)的生物利用度结果图Fig.4 Bioavailability of ART-PS(a) and artemisinin(b) in rats

本实验通过软件(DAS2.0)分别对实验数据进行模型拟合分析，经拟合计算后得到青蒿素原药和多孔淀粉负载青蒿素微球在大鼠体内的生物利用度参数值。青蒿素原药给药后的C max值为68.77 μg·mL-1，而多孔淀粉负载青蒿素微球给药后的Cmax值为199.74 μg·mL-1(表2～3)。多孔淀粉负载青蒿素微球在大鼠体内生物利用度的Cmax值是青蒿素原药的2.90倍。青蒿素原药给药后的Tmax值为4 h达到最大值，而多孔淀粉负载青蒿素微球给药后2 h就达到最大值，说明多孔淀粉负载青蒿素微球与青蒿素原药相比较，在大鼠体内的释放速度更快，发挥药效更强。青蒿素原药在大鼠体内的分布半衰期t1/2(h)为10.10 h，而多孔淀粉负载青蒿素微球在大鼠体内的分布半衰期t1/2(h)为26.28 h。此结果表明，多孔淀粉负载青蒿素微球比青蒿素原药在大鼠体内代谢所需要的时间更长。多孔淀粉负载青蒿素微球的分布半衰期是青蒿素原药的2.60倍，说明多孔淀粉负载青蒿素微球在大鼠体内发挥药效的时间更为持久。青蒿素原药口服后的AUC(0-t)值为551.96 μg·mL-1·h-1，而多孔淀粉负载青蒿素微球给药后的AUC(0-t)值为6681.33 μg·mL-1·h-1，多孔淀粉负载青蒿素微球在大鼠体内生物利用度的AUC(0-t)值是青蒿素原药的12.10倍，说明多孔淀粉负载青蒿素微球在大鼠体内的生物利用度较青蒿素原药明显提高。青蒿素原药给药后的MRT(0-t)值为12.24 h，而多孔淀粉负载青蒿素微球给药后的MRT(0-t)值为31.52 h，多孔淀粉负载青蒿素微球在大鼠体内生物利用度的MRT(0-t)值明显增高，是青蒿素原药的2.58倍，结果表明，多孔淀粉负载青蒿素微球与青蒿素原药相比较，经给药后在大鼠体内的驻留时间更久，因此发挥药效的强度更高，在体内作用时间更长，具有快速缓释的药物特点。生物利用度的明显提高也再次证实了多孔淀粉负载青蒿素微球比青蒿素原药的粒径更小、水溶性更好、溶出速度更快的实验结果。

表2 青蒿素原药房室模型的生物利用度参数

Table 2 Bioavailability parameters of compartment model for ART

房室参数Compartment parameter单位Unit参数值Parameter valuet1/2(h)h10.10AUC(0-t)mg·L-1·h-1551.96AUC(0-∞)mg·L-1·h-1572.23MRT(0-t)h12.24MRT(0-∞)h14.29Tmaxh4.00Cmaxmg·L-168.77

表3 多孔淀粉负载青蒿素微球房室模型的生物利用度参数

Table 3 Bioavailability parameters of compartment model for ART-PS

房室参数Compartment parameter单位Unit参数值Parameter valuet1/2(h)h26.28AUC(0-t)mg·L-1·h-16681.33AUC(0-∞)mg·L-1·h-17374.09MRT(0-t)h31.52MRT(0-∞)h41.47Tmaxh2.00Cmaxmg·L-1199.74

2.3 组织分布规律

图5所示为大鼠灌胃多孔淀粉负载青蒿素微球4 h后的各组织器官(心、肝、脾、肺、肾、脑)， 各组织器官形态良好，未见异常。表4为大鼠灌胃青蒿素原药和多孔淀粉负载青蒿素微球后在各个时间点和各个组织中的平均药物浓度比较结果。各个组织器官中药物分布规律如图6所示，青蒿素原药和多孔淀粉负载青蒿素微球在灌胃30 min后，在大鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑各组织中均有分布，其中各个时间点的青蒿素原药和多孔淀粉负载青蒿素微球在肝脏和心脏中浓度较高，其次是肾脏和肺，在脑中有少量分布，而在脾脏中浓度最低。并且多孔淀粉负载青蒿素微球在不同时间点的各个组织中的药物平均含量均高于青蒿素原药。多孔淀粉负载青蒿素微球在6,8和12 h时组织中的药物浓度分别为心脏：2.325 0、2.431 0和0.619 0 μg·g-1；肝脏中依次为1.720 5、0.416 0和0.189 0 μg·g-1；脾脏中依次为0.186 0、0.143 0和0.081 0 μg·g-1；肺中依次为0.961 0、0.208 0和0.099 0 μg·g-1；肾脏中依次为1.689 5、0.832 0和0.350 0 μg·g-1；大脑中为0.372 0、0.260 0和0.108 0。青蒿素原药在大鼠的心脏中的含量依次为1.290 0、1.196 0和0.419 0 μg·g-1；肝脏中的含量依次为0.390 0、0.234 0和0.103 0 μg·g-1；脾脏中的含量依次为0.075 0、0.065 0和0.024 0 μg·g-1；肺部的含量为0.330 0、0.169 0和0.158 0 μg·g-1；肾脏的含量为0.915、0.312和0.166 μg·g-1；大脑中的含量为0.225 0、0.143 0和0.063 0 μg·g-1。

图5 大鼠灌胃多孔淀粉负载青蒿素微球4 h后处死取出的各组织器官 A.心脏；B.脑；C.脾；D.肾；E.肝；F.肺Fig.5 Rats were sacrificed for 4 h after intragastric administration of ART-PS A.Heart；B.Brain；C.Spleen；D.Kedney；E.Liver；F.Lung

图6 大鼠灌胃青蒿素原药和多孔淀粉负载青蒿素微球后各组织中的药物含量对比结果Fig.6 Comparison of the curcumin content of ART and ART-PS in tissues after oral administration of rats

Table 4 Comparison of the mean concentrations of ART and ART-PS in tissues after oral administration of rats(μg·g-1)

组织Tissue样品Sample0.5124681224心脏HeartART0.3000±0.041.7680±0.161.8900±0.061.5680±0.051.2900±0.041.1960±0.020.4190±0.040.1290±0.05ART-PS0.3875±0.052.3628±0.023.1175±0.131.6385±0.062.3250±0.052.4310±0.250.6190±0.040.2750±0.02肝LiverART0.1440±0.041.1180±0.060.9940±0.020.8680±0.020.3900±0.040.2340±0.090.1030±0.040.0610±0.05ART-PS0.3125±0.082.2308±0.152.6390±0.032.1895±0.041.7205±0.020.4160±0.070.1890±0.040.1420±0.05脾SpleenART0.0360±0.010.1820±0.020.1260±0.080.0840±0.010.0750±0.020.0650±0.090.0240±0.020.0410±0.01ART-PS0.1875±0.090.2112±0.100.4640±0.050.2320±0.050.1860±0.020.1430±0.090.0810±0.030.0630±0.03肺LungART0.1920±0.020.2860±0.040.5880±0.020.4620±0.080.3300±0.020.1690±0.080.1580±0.020.0340±0.01ART-PS0.2250±0.020.8976±0.031.8270±0.081.5225±0.060.9610±0.050.2080±0.050.0990±0.030.0710±0.06肾KedneyART0.1800±0.030.4160±0.080.8260±0.060.7980±0.050.9150±0.080.3120±0.090.1660±0.010.0810±0.06ART-PS0.2625±0.051.1088±0.031.9720±0.071.6240±0.061.6895±0.180.8320±0.020.3500±0.030.2200±0.04脑BrainART0.1080±0.010.2080±0.020.3920±0.020.2660±0.050.2250±0.020.1430±0.030.0630±0.040.0480±0.03ART-PS0.2625±0.040.5940±0.041.0005±0.080.4205±0.060.3720±0.050.2600±0.080.1080±0.080.0870±0.02

3 结论

本文在体外溶出实验中，以水、人工胃液和人工肠液为三种溶出介质，检测到多孔淀粉负载青蒿素微球的体外溶出率都明显高于青蒿素原药，分别是原药的4.04、3.59和3.82倍。在大鼠体内生物利用度的结果中，多孔淀粉负载青蒿素微球在大鼠体内的血药浓度明显高于青蒿素原药，生物利用度提高为青蒿素原药的2.90倍，而且代谢时间更长，从而发挥的药效更强。多孔淀粉负载青蒿素微球相比于青蒿素原药，在体外的溶出效果更好，在体内的吸收释放效果更佳。在组织分布的结果中，多孔淀粉负载青蒿素微球和青蒿素原药都主要分布在心脏和肝脏中，其中多孔淀粉负载青蒿素微球在不同时间各个组织中的相应含量都比原药高，本文为解决青蒿素因难溶于水而在实际应用中受限提供了重要的理论依据。Van Nijlen等人分别利用PVP K25、PVP、PEG共混聚合物为载体，使制备的固体分散体转化为无定形状态，从而提高了青蒿素原粉的溶解度，但在溶出速率与生物利用度方面的结果并未细致讨论[10]。Isacchi等人制备了青蒿素普通脂质体和PEG化长循环脂质体，成功在冷冻干燥的工艺条件下制备出了粒径在150 nm左右的青蒿素纳米粒，且分布较窄的具有良好稳定性冻干脂质体，但在溶出速率与生物利用度方面的结果欠缺[21]。对比与目前的研究结果，本文在多孔淀粉负载青蒿素微球的体外溶出和体内生物利用的研究方面提供了可靠的依据。