miRNA及其相关SNP在非小细胞肺癌预后中作用的研究概况

杨海慧，支金华，吴静蕊

（西安医学高等专科学校，陕西西安 710309）

原发性肺癌是迄今为止恶性程度最高的肿瘤之一，其死亡率在世界上所有肿瘤中最高。在所有原发性肺癌中，主要类型是非小细胞肺癌（NSCLC），占所有肺癌的85%以上。与小细胞肺癌相比，非小细胞肺癌对化疗相对不敏感，然而由于恶性肿瘤基因突变的异质性、多样性以及极其复杂的分子机制，再加上各种外部因素的影响，如吸烟史、T分期、手术方法和淋巴结清扫等，患者的预后不容乐观。因此本文就近几年与NSCLC预后相关的miRNA及其SNP的作用机制和相关研究方法做了归纳总结，为NSCLC的深入研究提供了理论依据。

1 miRNA及其相关SNP的作用机制

1.1 miRNA的作用机制

MicroRNA（miRNA）是在植物、动物和某些病毒中发现的非编码单链小分子RNA，含有19～25个核苷酸，其作用是RNA沉默和转录后对基因表达进行调控。在真核细胞中，miRNA首先转录成细胞核中的pri-miRNA，并在初始剪接后转运到细胞质中进行最终修饰，成为19～25 nt的成熟miRNA，并且成熟的miRNA可作为基因的转录调节因子。随着生物技术的发展进步和实验方法的丰富，miRNA的作用也逐步被证实，它能够通过其自身特异性结合位点识别并连接靶mRNA上3'端和5'端非翻译区序列上的特异性识别区域，反过来引起识别的mRNA的翻译抑制或降解，从而阻断靶基因的翻译和蛋白质的表达。人类约有1/3基因受到miRNA调控。

由于已经发现并证实了miRNA的作用，许多学术期刊都发表了关于miRNA的文章，研究人员密切关注它的发现和功能。目前，徐艳敏[1]、赫羽喆[2]等人均表示miRNA的研究主要集中在miRNA的发现和靶标的预测上，并且逐渐转变为生物制药和疾病控制方面的应用。由于miRNA与靶基因mRNA的结合位点通常位于靶mRNA的3'末端非翻译区，因此有关miRNA作用机制的研究主要集中在靶基因mRNA 3'末端非翻译区的miRNA和mRNA之间的相互作用。但 近 些 年 Orom UA，Place R F，Tay Y 等 开 始 了mRNA的5'UTR[3]、启动子区[4]和编码区[5]miRNA-mRNA相互作用的研究[6]。由于每个miRNA可识别多达20个靶基因转录的mRNA，即使miRNA转录本仅有22个碱基，仅占所有转录基因的1%～5%，但可以调节多达30%的功能基因的表达。近年来，越来越多的实验结论说明miRNA可以调控很多的生物学功能，如细胞分化、细胞凋亡、细胞周期、肿瘤的形成、病毒的复制和细胞的死亡等[7]。肿瘤形成的根本原因是DNA损伤。其中，miRNA的遗传变异是导致DNA修复缺陷最重要的原因，因此miRNA与癌症的发生和发展密切相关。

随着近年来科学技术的不断发展，有关miRNA在肿瘤发生发展及诱导凋亡中的作用机制研究已经成为很多科学家关注的热点[5]。miRNA有调节肿瘤的生物学特性，因此它既能作为肿瘤抑制基因，下调靶原癌基因的活性，它也可以作为肿瘤促进基因，下调靶肿瘤抑制基因的活性[8]。许多研究发现，特定肿瘤特异性miRNA水平的分析有助于肿瘤的早期诊断和预后评估[9]，为探索肿瘤侵袭、增殖和转移机制，寻找早期诊断标志物和新的治疗靶点研究提供了新的方向。

1.2 miRNA基因相关SNP的作用机制

随着miRNA的发现、高通量测序技术的发展以及研究水平的深化，miRNA相关的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）逐渐成为与肿瘤等各种疾病密切相关的生物学标志物。SNP可能在人类基因组每几百个碱基中引起一个突变，并且当miRNA结合位点SNP起作用时，便会影响miRNA-mRNA结合，从而导致疾病。因此，miRNASNP为各种疾病，特别是肿瘤的临床治疗提供了新的策略。

2 MiRNA-SNP和NSCLC

据文献报道，miRNA及其相关的SNP有望成为NSCLC临床治疗和疗效有效预后的预测指标，同时确定并证实了在肺癌及其他肿瘤中许多与发病风险、药物疗效、易感性评估、临床结局预测等多个方面关联的变异位点[10]。miRNA基因的SNP主要位于初级miRNA转录物（pri-miRNA）、miRNA前体（premiRNA）的茎-环结构区域，甚至是成熟miRNA序列中。miRNA基因的SNP主要通过影响miRNA的加工和/或影响miRNA-mRNA的相互作用来干扰miRNA的调控作用，与非小细胞肺癌患者的预后预测密切相关。NSCLC相关miRNA基因及其相关SNP的研究有利于解释肺癌发生发展的机制，明确肺癌的致病机制，对肺癌的诊断、治疗和提高患者的生存率具有重要意义。

3 检测NSCLC预后效果的常用研究方法

3.1 临床资料

选择患有非小细胞肺癌的病人和未患病的健康人群作为不同样本。定义非小细胞肺癌患者人群的标准:通过手术活检诊断为NSCLC并且没有肺癌家族史的患者。对照组纳入标准为:经过CT、PET-CT等临床检查结果，肺部占位性病变外渗、无刺激性干咳、痰中不带血或无血痰、无胸痛等相关症状，同一时期在医院体检的健康人群[11]。

3.2 NSCLC诊断与分期

通过开胸手术、纤维支气管镜检查等方式获取肺部组织，通过病理诊断证实，诊断为NSCLC。使用国际肺癌研究协会（IASLC）2009年第7版病理学标准进行NSCLC分期[12]。

3.3 样品采集及处理

NSCLC组和对照组患者晚8点后禁食，空腹12 h以上，早晨肘部静脉采血5 mL并提取DNA。

3.4 Taqman SNP基因分型

设计一对针对待检测的靶SNP位点序列的PCR引物和Taqman探针。设计的两个Taqman探针序列基本相同，除了SNP位点的碱基不同外，其他序列相同，5'末端用荧光基团标记，3'末端用淬灭基团标记。探针与模板DNA结合以覆盖靶SNP位点，当探针完整时，淬灭基团可吸收荧光基团发出的荧光，在实时定量PCR扩增期间，探针与模板退火，然后Taq DNA聚合酶切除探针5'端的荧光分子。游离的荧光基团远离淬灭集团后，脱离其抑制并发出荧光信号（参见图1）。通过实时PCR仪记录荧光颜色的变化，以确定SNP位点的特定基因型是纯合的野生型、杂合型还是纯合的突变型[13]。

图1 Taqman探针法原理

3.5 基因型鉴定

通过SDS软件Allelic Discrimination程序分析基因型，并检测由相同基因的不同等位基因标记的荧光集团和淬灭集团的荧光强度，判断待测样本的基因型[14]。

3.6 样本信息收集及临床随访

收集患者基本资料，包括姓名、性别、年龄、地址、电话号码、职业、婚姻状况、教育程度等；个人情况，包括肺癌家族史、吸烟史、长期用药史等。治疗情况，包括住院时间、影像变现、手术信息、出院时疗效、随访时间等。

患者出院3个月后接受第一次随访，专业人员电话咨询患者出院后是否进行过复查，包括:影像学检查、血清学检查等；是否有复发及再次手术治疗情况；是否重新接受过药物、放化疗、放疗；是否存在长期并发症以及患者的生存和死亡状况以及死亡时间。随访间隔时间为3个月，周期为3年。

3.7 临床预后分析方法

采用卡方检验和Fisher's检验分析患者的年龄、性别、吸烟史、病理类型、术后化疗、生存状态和复发状态等有无差异。然后使用Cox比例风险回归模型分析这些临床指标对总体存活率（OS）和无复发存活率（RFS）的影响。计算存活死亡及复发风险率（HRs）、95%置信区间和P值。在Cox回归分析中，使用诸如年龄、性别、吸烟史、病理类型和术后化学疗法等临床指标来相互校正。所有测试双侧P值小于0.05时才被判定为具有显著性差异。使用Kaplan- Meier生存曲线和Log-rank检验（对数秩检验）来评估不同患者组之间的总体存活率和无复发存活率是否存在差异。

4 问题和展望

NSCLC具有恶性程度高、发病隐匿、早期不易发现，预后效果差、5年生存率低等特点。为找到有效的治疗方案并改善预后状况，肿瘤标记物已被广泛应用于NSCLC的鉴定、治疗效果的观察和预后的监测中，此外，对肿瘤标记物的研究已从分子水平发展到基因水平。研究证实了NSCLC患者miRNA-SNP的异常表达，这与NSCLC患者的预后密切相关，已成为NSCLC预后的有效分子标记物。它为改善患者术后病情和降低复发死亡率提供了新的研究方向。但目前的研究还不够深入，如何将目前的研究结果与临床诊治、科学用药结合起来，为患者制定更个性化的治疗方案，如何分析预后价值还有待进一步研究。