粉丝加工废水发酵生产农用γ-聚谷氨酸工艺优化

贾玉萍，赵建文，李维焕，盖宇鹏，程显好＊

（1.鲁东大学 农学院，山东烟台 264000；2.烟台东方科技蛋白有限公司，山东招远 265400）

γ-聚谷氨酸是由L-谷氨酸和D-谷氨酸单体通过γ-酰胺键聚合而成的一种多肽分子，具有水溶性、生物可降解性、生物相容性、金属螯合性、可食无毒等优点[1-2]，在农业[3-4]、环保[5]、医药[6]、食品[7]和化妆品[8]领域应用前景广阔。目前，γ-聚谷氨酸主要通过化学合成、酶转化、提取、微生物发酵生产。早在1937年，Ivanovie等[9-10]从炭疽芽孢杆菌的荚膜中发现。随后Bovarniek等[11]研究发现，有些芽孢杆菌属细菌能在发酵培养基中分泌γ-聚谷氨酸。之后，微生物法发酵生产γ-聚谷氨酸的研究成为热点。和前三种方法相比，微生物发酵法生产工艺简单、易于调控、适用于大规模生产。微生物深层发酵所需原料价格较高，是目前市场价格居高不下的主要原因，因此，使用低成本的原料是降低γ-聚谷氨酸成本的关键。许多研究者都在寻找更廉价的组分，废料成为重要的方向之一[12-14]。Dan Zhang等[15]报道了利用未处理的甘蔗糖蜜和谷氨酸钠废液发酵生产γ-聚谷氨酸，环保、经济，通过分批补料发酵72 h使得γ-聚谷氨酸产量达到52.1 g/L。Chao Zhang等[16]研究了以鱼粉废水为廉价氮源，利用枯草芽孢杆菌生产γ-聚谷氨酸，产量达到25.07 g/L。虽然皆利用废液通过微生物发酵生产γ-聚谷氨酸，降低了生产成本，但是发酵周期长。

粉丝行业作为山东省招远市的支柱产业之一，占据了我国粉丝加工业的半壁江山。废水问题是粉丝行业存在的重要共性问题，每吨粉丝原料加工都伴随着12～15 t高浓度有机废水的产生，招远市每年产生的粉丝废水达600万吨以上。这些废水中含有丰富的蛋白质、膳食纤维、低聚糖等多种营养物质，COD、BOD、SS等指标极高，但此类污水治理难度大、投入成本高，同时造成了资源的严重浪费。所以如何将此类废水资源化利用，符合既要“金山银山”又要“绿水青山”的绿色生态生产理念。

本研究以粉丝加工废水为原料生产γ-聚谷氨酸，不仅可以解决粉丝加工行业废水处理问题，抵消废水处理成本，还可以解决γ-聚谷氨酸生产成本过高、使用局限的问题。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试剂

葡萄糖、牛肉膏、氯化钠、琼脂、谷氨酸钠、磷酸氢二钾，均为国产分析纯。

1.1.2 主要仪器

CP21电子天平、SBA-40E型生物传感分析仪、FE20 pH计、LCT-IDS-A净化工作台、HZQ-Q全温振荡器、LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器、鼓风干燥箱、HPS-400生化培养箱、凯氏定氮仪等。

1.1.3 试验菌种及废水

试验菌种:已提交至中国微生物菌种保藏中心保藏的菌株 Bacillus subtilis LD-9308。

粉丝废水:本研究中所用到的粉丝废水来自于烟台东方蛋白科技有限公司。

1.1.4 培养基

（1）斜面培养基:蛋白胨1%、牛肉膏0.3%、NaCl 0.5%、琼脂 2%，pH7.2。

（2）液体培养基（g/L）:蛋白胨1%、牛肉0.3%、NaCl 0.5%，pH7.2。

（3）发酵培养基（g/L）:葡萄糖2%、谷氨酸钠2%、磷酸氢二钾0.15%、粉丝废水，pH7.5。

1.2 培养条件

（1）斜面培养:挑取保藏菌种接种至斜面培养基中，37 ℃培养12～24 h，作为活化菌种备用。

（2）种子培养:挑取一环活化菌种接至盛有100 mL种子液的500 mL摇瓶中，置于摇床中37 ℃，200 r/min培养12 h，作为种子液备用。

（3）发酵培养:吸取上述种子液1 mL至含有100 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，放置于摇床培养，37 ℃，200 r/min培养 26 h，得到 γ- 聚谷氨酸发酵液。

（4）测定方法:高效液相色谱法（HPLC），按照企业标准 Q/FSK 001—2012。

1.3 试验方案

1.3.1 粉丝加工废水组成及特征参数测定

（1）pH:pH计测定。

（2）固体含量:取一定量粉丝加工废水在105～110 ℃烘干后，称重。

（3）粗蛋白含量:凯氏定氮法测定，GB/T5009.5-2016。

（4）还原糖:高锰酸钾滴定法，GB/T5009.7-2016。

（5）化学需氧量（COD）:重铬酸钾法，GB/T11914-1989。

1.3.2 单因素条件优化发酵培养基

（1）葡萄糖含量对γ-聚谷氨酸产量的影响。在基础发酵培养基的基础上，分别以0.50%、1.00%、1.50%、2.00%、2.50%、3.00%、3.50%、4.00%、4.50%和5.00%的葡萄糖含量梯度进行实验，来考察葡萄糖含量对γ-聚谷氨酸产量的影响。

（2）谷氨酸钠含量对γ-聚谷氨酸产量的影响。在基础发酵培养基的基础上，分别设置2%、3%、4%、5%和6%含量梯度的单因素条件，测定γ-聚谷氨酸产量。

（3）磷酸氢二钾含量对γ-聚谷氨酸产量的影响。在基础发酵培养基的基础上，分别设置0%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%、0.45%和0.50%的磷酸氢二钾含量梯度的单因素条件，测定不同含量对γ-聚谷氨酸产量的影响。

1.3.3 单因素条件优化发酵条件

（1）发酵时间。考察不同发酵时间20、22、24、25、26、28 h 和 30 h 下 γ- 聚谷氨酸的产量，以确定最佳发酵时间。

（2）初始pH。调节培养基的初始pH值分别为6.00、6.50、7.00、7.25、7.50、7.75、8.00，发 酵 培养一定时间，测定γ-聚谷氨酸的产量。

1.3.4 正交试验发酵工艺优化

利用SPSS软件进行正交试验设计，在单因素试验结果的基础上对培养基配方中葡萄糖含量、谷氨酸钠含量、磷酸氢二钾含量行正交试验，每组实验3个平行，测定γ-聚谷氨酸含量，以选出最优组合。因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平

2 结果与分析

2.1 粉丝加工废水组成及特征参数结果

测定10个批次的废水成分，其组成及特征结果见表2。由表2可知，受前段生产工艺的影响，废水的固形物含量会有波动，但其pH值、碳氮比比较稳定。

表2 粉丝加工废水组成及特征

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 单因素条件优化发酵培养基结果与分析

（1）葡萄糖含量对γ-聚谷氨酸产量的影响。葡萄糖含量在0.5%～2.0%时，γ-聚谷氨酸产量随葡萄糖含量的增加而增多，在2.0%时产量最高，高达31.76 g/L。之后，γ-聚谷氨酸产量随葡萄糖含量增加而下降，结果如图1所示。葡萄糖是微生物生长所需能量的重要来源，葡萄糖含量对目标产物的积累有很重要的影响。

图1 葡萄糖含量与γ-PGA产量的关系

（2）谷氨酸钠含量对γ-聚谷氨酸产量的影响。如图2所示，谷氨酸钠含量在2%～5%时，γ-聚谷氨酸的产量随着谷氨酸钠含量的增加而增加，在5%最高可达41.89 g/L，之后开始下降。由于谷氨酸钠是合成γ-聚谷氨酸的前体物，在添加谷氨酸钠的情况下，γ-聚谷氨酸的产量能够得到较大的提升，但过高的前体物存在反而会抑制γ-聚谷氨酸的生成。

（3）磷酸氢二钾含量对γ-聚谷氨酸产量的影响。磷酸氢二钾对γ-聚谷氨酸的产量影响较大，其含量在0.25%时γ-PGA产量最高，超过0.25%以后，产量呈下降趋势，如图3所示。

图2 谷氨酸钠含量与γ-PGA产量的关系

图3 磷酸氢二钾含量与γ-PGA产量的关系

2.2.2 单因素试验优化发酵条件

（1）发酵时间。如图4所示，发酵时间为20～26 h时，γ-聚谷氨酸产量随时间的增长而增加，在26 h时最高，达49.16 g/L，随后产量开始下降，因此确定26 h为最佳发酵时间。发酵时间对于目标产物的积累具有很重要的影响。时间过长会导致产物降解，时间过短会使得产物不足。在发酵过程中，不仅要满足发酵生产中菌种对于营养条件的要求，还需要维持菌种适宜的发酵培养条件的稳定。

图4 发酵时间与γ-PGA产量的关系

（2）初始pH。如图5所示，pH值在6.0～7.5范围内，γ-聚谷氨酸产量随pH的增长而增加，在7.5产量最高达50.68 g/L，之后产量开始下降。

发酵过程中培养基的pH值对菌体的生长和产物的合成有很大的影响。pH是反映微生物发酵过程当中培养条件是否稳定的重要指标，是一项重要的发酵参数，酸碱度的变化很大程度上影响着菌体的生长状态。pH值的变化在调节酶活、维持微生物细胞的运输机制等方面都起着重要作用，pH值的变化也会促进或抑制一些营养物质的吸收，甚至能够影响菌体的生长和发酵产物的合成，因此确定发酵过程的最适pH值是保证或提高产量的重要环节[17]。

图5 pH与γ-PGA产量的关系

2.3 正交试验对发酵培养基成分含量优化结果与分析

正交试验结果见表3。由表3可知，B因素是影响指标值的最主要因素，即谷氨酸钠含量对γ-聚谷氨酸产量的影响最大。

表3 正交试验设计及结果分析

各因素对γ-聚谷氨酸产量影响主次顺序为B＞A＞C，最佳组合为A2B3C3，在初始pH为7.5，发酵时间26 h的条件下，得到γ-聚谷氨酸产量为53.7 g/L。

3 结论

为了实现资源合理利用、降低聚谷氨酸生产成本，利用粉丝废水发酵生产聚谷氨酸，并优化了发酵培养基配方及条件:葡萄糖2%，谷氨酸钠5%，磷酸氢二钾0.3%，初始pH值7.5，121 ℃灭菌20 min，500 mL 三角瓶，装液量 100 mL，摇床转速200 r/min，37 ℃振荡培养 26 h。

聚谷氨酸作为一种新型、高效的农肥和植物增产剂，能亲水保水、平衡土壤酸碱度、结合沉淀重金属、增强植物抗病抗逆能力。目前限制其在农业大规模推广应用的主要因素是价格高。本研究以粉丝加工废水为主要原料生产农用聚谷氨酸，降低产品生产成本的同时，也消除了难以处理的废水，节约了企业污水处理费用。通过原料创新、工艺创新，使产品生产成本大大降低，经济效益、环境效益显著。