miRNA-223在急性心肌梗死患者血清中的表达及其对心肌细胞凋亡的影响

韩明磊，金卫东，刘振，王成，崔佳佳，李艳茹，王雪慧

急性心肌梗死（AMI）是冠状动脉（冠脉）疾病最严重的表现形式之一，是欧美等发达国家致死率第三高的疾病[1]。缺血再灌注损伤会引起心肌细胞产生氧自由基增多和心肌细胞钙超载，加重心肌细胞凋亡和坏死，临床表现为再灌注心律失常、心肌梗死面积扩大及心功能恶化等[2]。因此，研究加重心肌细胞凋亡和坏死的分子机制，为心肌保护作用的药物奠定理论基础，进而达到降低心肌梗死死亡率和并发症发生率的临床目的。

microRNA（miRNA）是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控，通过对其靶基因转录的调控参与到调控细胞的生命活动。近年来多项研究表明，microRNA的异常表达与癌症[3-5]、心血管疾病[6-8]和类风湿性关节炎[9-11]等多种疾病的发生发展有关。Liu等[12]在动物实验中发现，miR-223在AMI大鼠中高表达，并且敲低内源性miR-223-3p可能是抗心律失常治疗的新方法。但目前尚无研究报道miR-223在AMI患者血清中的表达，以及其表达对人心肌细胞凋亡的影响。本文通过对比67例AMI患者和50例健康人群血清miR-223的表达水平，并以HCM细胞为模型探讨miR-223表达对心肌细胞凋亡的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象与临床资料随机选取2015年1月至2017年1月于新乡市中心医院血管内科因胸闷胸痛收治，并确诊为[7]AMI的患者67例为AMI组，其中男性40例，女性27例，年龄38～72岁，平均年龄（52.3±8.1）岁。同时随机选取同时期在我院进行体检的健康人50例作为对照组（Control组），其中男28例，女22例，年龄42～73岁，平均年龄（53.9±6.7）岁。本次研究AMI组排除：①胸闷胸痛具体时间不详，或者胸闷胸痛后超过12小时采血患者；②合并恶性肿瘤、肝肾功能不全或者HIV、乙肝等慢性感染性疾病；③入组前三月内进行过手术治疗，或者入组前半年内因病毒、真菌、细菌感染入院治疗的患者；④体质指数（BMI）＜18.5 kg/m2或者＞24 kg/m2；⑤治疗过程中出现死亡；⑥年龄、性别或其他本次研究所需临床资料不全的患者。此外，本次研究所有入组患者均对研究内容知情并签订知情同意书。

1.2 实时荧光定量PCR向200 μl血浆加入1000 μl QIAzol裂解试剂（QIGEN，德国），静置15 min，根据miRNeasy血清/血浆试剂盒（QIGEN，德国）中的方案提取RNA。使用适量的DEPC水来溶解总RNA。根据PrimeScript miRNA cDNA合成试剂盒（Takara，日本）合成cDNA.cDNA合成PCR参数设置：42℃ 15 min和85℃ 5 s。

实时荧光定量PCR：根据SYBR Premix Ex TaqTM II（TakaRa，日本）制备20ul RT-qPCR反应体系，并使用ABI 7500荧光定量PCR仪器（Applied Biosystems，USA）进行扩增。PCR参数设置：95℃-30 s，90℃-5 s，65℃-30 s，共40个循环。PCR引物：miR-223-F：5'-AC ACTCCAGCTGGGTGTCAGTTTGTCAAAT-3'，miR-223-R:5'-TGGTGTCGTGGATTCG-3'；U6-F:5'-CTCGCTTCGGCAGCACA -3'，U6-R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；CCTN2-F：5'-GGAGTGGAGGCGGATAAAGAG-3'，CCTN2-R:5'-AGAGACATTGAGACGCTGTCC-3'；GAPDH-F：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，GAPDH-R：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATG G-3'。

1.3 临床指标的测定用EDTA收集外周血（5～10 ml），然后离心（1000×g）10 min（5810R，Eppendorf AG，德国）以收集血浆。用自动生化分析仪（AU680，Beckman Coulter，USA）测定血浆采用全自动生化分析仪（AU680，Beckman Coulter，USA）测定总胆固醇（TC），三酰甘油（TG），高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的血浆水平。

1.4 HCM细胞的培养与处理转染前1 d将人心肌细胞（HCM）传代（在转染当天细胞密度为70%-90%）。miRNA-223模拟物（5'-ACA GCAGGTGTCAGTTTGCAG-3'，Sangon Biotech（Shanghai）Co.，Ltd.）和阴性对照（5'-UUCUC CGAACGUGUCACGUTT-3'）使用Lip2000脂质体转染miRNA。转染后6 h用正常培养基代替培养基，转染后24 h用H2O2（终浓度50 μM）处理一组转染细胞。再培养24 h后，分离并收集细胞。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡收集经不同方式处理后的HCM细胞加入70%预冷乙醇（预冷PBS与无水依次配置）4度固定过夜，然后经PBS清洗、PI处理后，通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.6 荧光素酶报告基因验证miR-30a-5p靶基因通过miRanda和PicTar等网站，并结合NCBI查找CCTN2基因3'-UTR与miR-223结合的部位，然后将这段3'-UTR的野生型（WT）和突变型（MUT）克隆到经Sac I和Sal I双酶切后的pmirGLO质粒（addgene，美国）上，将构建的重组质粒与miR-223-mimic或者miR-223-NC共转到HCM细胞内，转染48 h后，收集细胞通过Dual-Luciferase系统（Promega，中国）检测荧光素酶荧光强度。

1.7 统计学分析方法研究数据通过统计学分析软件SPSS 20.0进行分析，计数资料以百分比形式表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以均值±标准差形式表示，组间比较采用独立样本t检验。建立Logistic回归模型以确定与AMI发病相关的假定危险因素的优势比（OR）和95%置信区间（CI），以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组研究对象一般临床资料比较对比50例健康人和67例AMI患者一般资料发现：两组研究对象在年龄、性别、BMI以及是否吸烟上差异无统计学意义（P＞0.05），在合并高血压以及血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平上差异具有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

2.2 miR-223在AMI患者血清中高表达实时荧光定量PCR用于测定117例研究对象血清miR-223相对表达水平，结果显示：miR-223在67例AMI患者血清中的相对表达水平为（5.58±0.99），高于其在50例健康人血清（0.66±0.15）的相对表达水平（P＜0.05）（图1）。

2.3 Logistic回归分析以AMI（0=无，1=有）作为因变量，年龄、性别（0=女，1=男）、吸烟（0=是，1=否）、合并高血压（0=否，1=是）以及连续变量BMI， TC，TC， HDL-C和LDL-C等作为独立自变量进行Logistic回归分析，结果显示：miR-223是AMI发病的独立危险因素（95%CI：0.859-0.251，P＜0.001）（表2）。

表1 50例健康人与67例AMI患者一般资料比较（x±s）

图1 miR-223在AMI患者血清中高表达

2.4 miR-223靶向抑制CCTN2在HCM细胞中的表达通过miRanda和PicTar等网站，结合NCBI查找CCTN2基因3'-UTR与miR-223结合的部位（图2A），荧光素酶基因报告系统实验证实（图2B）：在HCM细胞中，CCTN2是miR-223的靶点；通过向HCM细胞中转入miR-223-mimic可促进miR-223在HCM细胞中的表达（图2C），并抑制CCTN2基因在HCM细胞中的表达（图2D-F）。

表2 AMI发病影响因素Logistic回归分析结果

2.5 miR-223高表达促进H2O2诱导的HCM细胞凋亡H2O2是一种强氧化剂，加入到细胞的培养液中会诱导细胞凋亡，本研究发现：在不加入双氧水诱导的条件下，转入miR-223-NC和转入miR-223-mimic的HCM细胞都会由于转入外源核酸而导致细胞死亡，但两者对HCM细胞凋亡的影响情况无显著差异（P＞0.05），但向两者中均加入H2O2后，转入miR-223-mimic的HCM细胞凋亡率高于miR-223-NC（P＜0.05）（图3）。

图2 miR-223靶向抑制HCM细胞表达CCTN2

图3 miR-223高表达促进H2O2诱导的HCM细胞凋亡

3 讨论

MicroRNA是一类在真核细胞中发现的、由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，通过对其靶基因转录的调控参与到真核细胞的分化、增殖、生长和凋亡的调解[13]。在心血管疾病的中，miRNA不仅通过对其靶基因的调控而在心肌肥大、心肌坏死和凋亡中发挥着举足轻重的作用，并且参与AMI发病的每个过程[14-16]。同时由于miRNA在血液中异常的稳定，并且对各种病理生理条件下表达差异明显，是一种理想的疾病血液检测生物标志物：Liu等[17]研究指出，血浆miR-1，miR-208和miR-499是汉族人群AMI的潜在预测生物标志物。

本文研究发现，miR-223在67例AMI患者血清中的相对表达水平为（5.58±0.99），高于其在50例健康人血清（0.66±0.15）的相对表达水平（P＜0.05），并且经Logistic回归分析显示miR-223是AMI发病的独立危险因素（95%CI：0.859～0.251，P＜0.001）。在动物实验中，Liu等[12]发现miR-223-3p在进行心肌梗死大鼠中呈现高表达，并且高表达的miR-223-3p可以靶向抑制大鼠心室心肌细胞K+通道相关蛋白Kv4.2的表达，而miR-223-3p敲出大鼠可以有效的降低心律失常的发生率。结合本文我们的研究，我们可以肯定无论是在AMI动物还是AMI患者，miR-223是高表达，并且高表达的miR-223可以通过对比靶基因表达的调控而参与到心肌细胞的生物学活动中。

miRNA哺乳动物细胞生物学功能的调控主要是通过对其靶基因翻译或者转录水平的调控来实验。miRNA识别并与靶标基因3′UTR区部分配对，从而抑制靶标基因的翻译是miRNA对靶基因表达进行调控的主要方式。本文通过miRanda和PicTar等网站，并结合NCBI查找CCNT2基因3'-UTR与miR-223结合的部位，通过荧光素酶报告基因系统证实miR-223靶向抑制CCTN2的表达。CCNT2是由CCNT基因编码的高度保守的细胞周期蛋白家族，作为CDK激酶的调节剂而对细胞周期的发挥调节功能[18]。Ke等[18]研究中指出，miR-192可以通过靶向抑制CCNT2蛋白的表达而将人急性早幼粒白血病细胞阻滞在G0/G1期，进而达到抑制其增殖和促进其凋亡的目的。而miR-223是一种造血特异性microRNA，在骨髓谱系发育中具有关键功能，以为关于其的研究发现miR-223表达水平不仅可抑制急性淋巴细胞白血病患者造血细胞的增殖[19]，而且与肝局部缺血患者血清标志物密切相关，并且指出肝脏缺血/再灌注损伤可能是另一种与miR-223表达改变相关的肝脏疾病。由此我们可以看出，miR-223可能通过对CCNT2蛋白的表达而对心肌梗死引起的心肌细胞凋亡产生影响，而我们通过向HCM细胞中加入H2O2诱导其凋亡的实验也证实了这点，即miR-223可以通过靶向抑制HCM细胞中CCNT2基因的表达而促进H2O2诱导的HCM细胞凋亡。

综上所述，miR-223在AMI患者血清中高表达，并且高表达的miR-223可能通过靶向抑制心肌细胞CCTN2的表达而促进其凋亡。