转染bFGF基因的BMSCs移植对急性心肌梗死大鼠再灌注损伤的影响及机制探讨

王倩，任琳，张鹏宇，李芳，杨桂凤

急性心肌梗死（AMI）是造成心力衰竭的重要病因，AMI可导致心肌细胞产生不可逆损伤，且心肌细胞较难有效自我增殖和修复[1]。目前，AMI主要治疗手段包括药物干预、冠状动脉（冠脉）旁路移植术、经皮冠状动脉介入治疗（PCI）均可恢复缺血后再灌注，但仍不能有效修复已受损心肌细胞，正常心功能较难恢复[2]。因此，亟需寻找有效治疗方法，以减轻AMI再灌注损伤、改善心功能。近年来，随着生物工程技术的不断发展，干细胞移植技术逐渐得到关注和重视。骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有多向分化潜能，通过应用诱导剂使其分化为心肌细胞，治疗AMI再灌注后所致心功能不全，但其效果仍存在争议[3]。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）在多种细胞增殖、分化中起重要作用，且与心肌细胞受损后修复关系紧密[4]。因此，本研究将PBR322-bFGF质粒转染至BMSCs中，观察转染bFGF基因的BMSCs移植对AMI再灌注后心功能、炎症反应及心肌细胞凋亡的影响，为临床中利用干细胞移植治疗AMI再灌注损伤奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物SPF级雄性SD大鼠，48只，4周龄，体质量90～110 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2016-0001，小鼠均自由摄食（普通饲料）、饮水，饲养于（24±1）℃，60%恒湿、12 h/12 h明暗循环条件下。

1.1.2 主要试剂和仪器质粒PBR322-bFGF（军事医学科学院）、低糖DMEM培养基（GIBCO公司）、胎牛血清（Hyclone公司），大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-10（IL-10）酶联免疫吸附试验试剂盒（R&D公司），逆转录试剂盒（Takara公司），BCA蛋白定量分析试剂盒（Thermo公司），小鼠抗大鼠CD90、CD105、CD34、CD45单抗（Biolegend公司），兔抗大鼠bFGF多抗，MM-9单抗、TIMP-1多抗（Santa Cruz），HRP标记的羊抗兔IgG抗体（Sigma）；DH-150动物呼吸机（浙大医学仪器厂），ECG-6511型心电图仪（上海光电医用电子仪器有限公司），DSX100光学显微镜（奥林巴斯公司），RM2245徕卡切片机（Leica公司），3550UV酶标仪、7500实时荧光定量PCR仪、PE2400电泳仪、CheniDoc XRS化学发光成像分析系统（Bio-rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs体外分离及培养大鼠引颈处死后，无菌条件取股骨及胫骨，去除两端干骺端，用低糖DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，1000 rpm离心5 min后弃去上清，DMEM重悬后加入淋巴细胞分离液，采用密度梯度离心法获取纯化细胞，接种至DMEM培养基（含10%胎牛血清）、37℃、5%CO2、饱和湿度下培养，取第3代BMSCs细胞，消化后调整细胞密度至1×106个/ml，接种于含有盖玻片的细胞培养板中，倒置显微镜观察细胞成单层生长时取出盖玻片，洗涤3次后与95%酒精中固定15 min，洗涤后3%过氧化氢服用10 min，加入蛋白阻断剂室温封闭10 min，甩掉阻断剂后滴加鼠抗CD90、CD105、CD34、CD45抗体4℃摇床孵育过夜，加入FITC标记羊抗兔二抗避光孵育30 min，洗涤后晾干，甘油封片后置于纤维镜下观察，选择CD90+、CD105+，CD34-、CD45-即为骨髓BMSCs细胞。

1.2.2 质粒bFGF转染BMSCs采用lipofectamine 2000脂质体转染法，将纯化的bFGF质粒、脂质体及BMSCs细胞混匀后，置于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养6 h，换液后继续培养36 h，将培养液换为含5 mg/L的Blasticidin培养基孵育过夜，之后每3～4 d换液1次（含5 mg/L的Blasticidin），经10～12 d筛选后，获得转染bFGF基因的BMSCs细胞（经实时荧光定量-聚合酶链反应法鉴定BMSCs转染bFGF成功）。进行移植前，加入50 mg/L的BrdU同条件培养48 h进行标记。

1.2.3 急性心肌梗死（AMI）再灌注模型建立及分组干预取40只大鼠，其中30只用2.5%戊巴比妥钠麻醉后，四肢连接心电图检测仪，气管插管连接实验动物呼吸机给予正压通气，于左胸第4肋间开胸，乳突牵开器牵开肋骨，暴露心脏，6-0无创带针缝合针从左冠状动脉前降支穿过，进针深度约1.5 mm，在缝合线下放置直径为2.0 mm的聚乙烯管进行结扎，当心电图出现ST弓背向上型抬高提示AMI成功，100 min后剪短结扎线恢复血供，出现再灌注性心律失常，且结扎线以下动脉充盈并由搏动提示AMI再灌注造模成功[5]，将造模成功大鼠按照随机数表法分为模型组、BMSCs组、BMSCs+bFGF组，模型组在梗死周边心外膜区用微量注射器分4点注射DMEM培养基，每点200 μl，BMSCs组同部位注射等量未转染BMSCs，BMSCs+bFGF组同部位注射等量转染bFGF的BMSCs。其余10只大鼠同前手术操作步骤，仅穿线不结扎持续100 min，设为假手术组，在心脏同位置分点注射培养基。术后逐层缝合切口，呼吸平稳后拔出气管插管，常规给予抗生素预防感染。操作过程中死亡大鼠采用同期饲养大鼠补入。

1.2.4 心功能检测术后4周，异氟烷麻醉大鼠，采用多普勒超声仪进行心脏超声检查，记录各组大鼠左心室舒张末期内径（LVIDd）、收缩末期内径（LVIDs）、缩短分数（FS）、射血分数（EF）。所有检测值均取4个心动周期的平均值。

1.2.5 血清TNF-α、IL-1β、IL-10水平检测术后4周，大鼠眼眶采血5 ml，3000 rpm离心10 min，取上层血清，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-10含量，严格按照试剂盒说明书步骤操作，酶标仪检测450、460、462 nm处吸光度值，设570 nm为校正波长，根据标准曲线计算血清TNF-α、IL-1β、IL-10含量。

1.2.6 心肌组织病理学观察术后4周后，处死大鼠后立即开腹暴露心脏，取紧靠左心室前侧壁心肌组织，放入4%多聚甲醛固定24，常规酒精梯度脱水、石蜡包埋后，制作4 mm连续切片。切片经二甲苯脱蜡后、酒精梯度水化，采用常规苏木精-伊红染色法（HE）进行染色，中性树胶封片后观察心肌组织病理学变化。

1.2.7 心肌细胞凋亡指数（AI）检测术后4周处死大鼠，取心脏制作常规石蜡切片，切片常规脱蜡、水化后，滴加3%的过氧化氢孵育5 min，然后加入蛋白酶K于37℃孵育30 min，滴加pH6.0枸橼酸盐缓冲液进行高压修复1.5 min。严格按照TUNEL检测试剂盒说明书操作：每张切片滴加TUNEL反应液混合液25 μl，37℃避光孵育1 h，洗涤后，滴加DAB显色液100 μl室温孵育3 min，苏木精核染1 min、盐酸乙醇分化1～3 s、碳酸锂返蓝20 s，晾干后中性树脂封片，光镜下观察，每张切片随机选择5个视野拍照，用应用Image Pro Puls 6.0软件分析，计算AI=阳性细胞/细胞总数×100%。

1.2.8 bFGF、MMP-9、TIMP-1 mRNA相对表达量检测处死小鼠取心脏组织，加入液氮并研磨后，Trizol法提取组织中总RNA。用逆转录试剂盒将mRNA逆转录cDNA。产物经琼脂糖凝胶电泳法鉴定后，进行实时荧光定量PCR，严格按照试剂盒说明书设定反应体系：SYBR Premix Ex Taq 12.5 μl，10 μmol/L上下游引物各0.5 μl，cDNA 2 μl，ddH2O 9.5 μl；反应条件：95 ℃预变性2 min；94 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，重复40个循环。以β-actin为管家基因，2-△△CT为目的基因的相对表达强度，所有实验重复3次取Ct平均值。采用凝胶成像系统测定bFGF、MMP-9、TIMP-1 mRNA相对表达量。bFGF：上游引物：5'-GCTAGCTGATCGTAGTC GTACGT-3'；下游引物：5'-CTATCGTACGTA GCTAGCTAGTCG-3'；MMP-9：上游引物：5'-ATCGATCGATCTCGTATCTGTATC-3'；下游引物：5'-CGTAGCTAGCTAGCTGTACGTAT-3'；TIMP-1：上游引物：5'-CGTAGCTAGCTAGCTA TCGTACA-3'；下游引物：5'-GTCAGTCGATG CTAGCTAGCTAG-3'；β-actin：上游引物：5'-CTGACTAGTCGTACGTAGCTACA-3'；下游引物：5'-CGTAGCTGATCGTATCGTAGCTC-3'。

1.2.9 bFGF、MMP-9、TIMP-1蛋白相对表达量检测取75 mg左右心肌组织，液氮中研磨后转至离心管，加入0.5 ml细胞裂解液，置于100℃水浴中10 min，离心后取上清液，二喹啉甲酸（BCA）法进行蛋白定量。取60 μg样品加入等体积上样缓冲液混匀后，100 ℃水浴加入3 min，12 000 rpm离心10 min取上清液，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）电泳分离，电转仪电转40 min，加入封闭液室温摇床2 h，加入封闭液稀释一抗（1:500），4 ℃摇床孵育过夜，加入封闭液稀释二抗（1:10000），常温孵育0.5 h，暗室中曝光、显影及定影。应用凝胶成像系统扫描并进行灰度值分析，以bFGF、MMP-9、TIMP-1蛋白灰度值与内参β-actin灰度值比值表示蛋白相对表达量。

1.3 观察指标①BMSCs细胞分离及鉴定结果；②心功能指标对比；③血清TNF-α、IL-1β、IL-10水平对比；④心肌组织病理学观察及AI对比；⑤ bFGF、MMP-9、TIMP-1 mRNA相对表达量、MMP-9/TIMP-1值对比；⑥bFGF、MMP-9、TIMP-1蛋白相对表达量、MMP-9/TIMP-1值对比。

1.4 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件对数据分析处理，计量资料均采用均数±标准差（x±s）表示，心功能、血清炎性因子、AI、基因及蛋白的相对表达量多样本计量资料比较采用单因素方差分析，两两样本比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSCs细胞分离及鉴定结果原代BMSCs培养第3 d开始贴壁生长，呈多边形或纺锤形，传代培养至第3代时体积增大，呈长梭行，大小均一。免疫细胞荧光法鉴定BMSCs特征表型，CD90、CD105阳性表达率分别为96.03%、95.44%，CD34、CD45均呈阴性表达，符合BMSCs的典型特征表型（图1～2）。

图1 BMSCs分离培养形态学观察

图2 BMSCs表面特征抗原鉴定（×200）（图A：CD90；图B：CD105；图C：CD34；图D：CD45）

2.2 心功能指标对比LVIDd、LVIDs组间比较，假手术组最低、BMSCs+bFGF组其次、BMSCs组稍高、模型组最高，每两组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05），EF、FS组间比较，假手术组最高、BMSCs+bFGF组其次、BMSCs组稍低、模型组最低，每两组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

2.3 血清TNF-α、IL-1β、IL-10水平对比血清TNF-α、IL-1β水平组间比较，假手术组最低、BMSCs+bFGF组其次、BMSCs组稍高、模型组最高，每两组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05），IL-10组间比较，BMSCs+bFGF组最高、BMSCs组其次、模型组稍低、假手术组最低，每两组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

2.4 心肌组织病理学观察及AI对比AI组间比较，假手术组最低、BMSCs+bFGF组其次、BMSCs组稍高、模型组最高，每两组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）（表3、图3～4）。

2.5 bFGF、MMP-9、TIMP-1 mRNA相对表达量、MMP-9/TIMP-1值对比bFGF、TIMP-1

表1 心功能指标对比（x±s）

表2 血清TNF-α、IL-1β、IL-10水平对比（x ±s，pg/ml）

表3 AI对比（x±s）

图3 心肌组织HE染色（×400）（a～d分别为假手术组、模型组、BMSCs组、BMSCs+bFGF组）

图4 心肌组织TUNEL染色（×400）（A～D分别为假手术组、模型组、BMSCs组、BMSCs+bFGF组）

mRNA相对表达量组间比较，BMSCs+bFGF组最高、BMSCs组其次、模型组稍低、假手术组最低，每两组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；MMP-9 mRNA相对表达量、MMP-9/TIMP-1值组间比较，假手术组最低、BMSCs+bFGF组其次、BMSCs组稍高、模型组最高，每2组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）（表4）。

2.6 bFGF、MMP-9、TIMP-1蛋白相对表达量、MMP-9/TIMP-1值对比bFGF、TIMP-1蛋白相对表达量组间比较，BMSCs+bFGF组最高、BMSCs组其次、模型组稍低、假手术组最低，每2组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；MMP-9蛋白相对表达量、MMP-9/TIMP-1值组间比较，假手术组最低、BMSCs+bFGF组其次、BMSCs组稍高、模型组最高，每2组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。结果见图5～6。

表4 bFGF、MMP-9、TIMP-1 mRNA相对表达量、MMP-9/TIMP-1值对比（x±s）

3 讨论

图5 蛋白免疫印迹图

图6 bFGF、MMP-9、TIMP-1蛋白相对表达量、MMP-9/TIMP-1值对比

心肌细胞对缺血、缺氧及氧化应激等多种应激十分敏感，且心肌细胞的再生和自我修复能力差，AMI后再灌注时由于心肌细胞受到再灌注血流的应激，可再次诱发多种病理反应，最终可导致AMI后存活的部分细胞再次死亡[6,7]。因此，在对AMI后患者进行再灌注治疗时，应选用有效的预防性手段，减少心肌细胞凋亡，保护患者正常心功能，对患者预后意义重大。BMSCs来源于中胚层，具有遗传稳定、多向分化、免疫耐受及旁分泌等多种生物学活性，且BMSCs可自体取材，排异风险低，临床应用较易实现，在细胞移植治疗方面具有较大优势[8]。

本研究发现，免疫细胞荧光法鉴定BMSCs出现CD90、CD105阳性表达，CD34、CD45阴性表达的典型特征表型，提示成功分离获得BMSCs。LVIDd、LVIDs、TNF-α、IL-1β、AI比较，假手术组最低、BMSCs+bFGF组其次、BMSCs组稍高、模型组最高（P＜0.05），FS、EF比较与上述结果相反（P＜0.05）；IL-10比较，BMSCs+bFGF组最高、BMSCs组其次、模型组稍低、假手术组最低（P＜0.05），提示转染-bFGF质粒的BMSCs可显著改善AMI后再灌注大鼠的心功能、缓解炎症反应，并且可减少心肌细胞凋亡。研究证实[9]，在心肌局部注射BMSCs后，处于局部心脏微环境的BMSCs可被诱导分化为心肌样细胞，其功能与机体原有心肌细胞相似，进而改善心功能。bFGF是一种有丝分裂原，可促进血管生成及创伤修复，应用转染bFGF基因的BMSCs，使心肌组织中分泌更多bFGF，有效改善心脏微环境，更利于干细胞定向分化，改善心功能[10]。bFGF可通过促进各种炎性细胞的粘附和趋化，调节炎症因子浸润部位，有效抑制AMI再灌注损伤产生的炎症反应，降低炎症因子TNF-α、IL-1β合成，增加IL-10的合成和分泌，缓解炎症反应[11]。动物实验研究表明[12]，在大鼠AMI后给予bFGF，可显著减轻缺血再灌注损伤，可能是bFGF促进血管生成，血管密度增加可对抗氧化应激的缘由，进而减少心肌细胞凋亡和坏死。转染bFGF基因的BMSCs移植后，BMSCs与bFGF共同促进AMI再灌注后心功能恢复，并且可缓解缺血再灌注损伤。

M M P-9 m R N A和蛋白相对表达量、MMP-9/TIMP-1值组间比较，假手术组最低、BMSCs+bFGF组其次、BMSCs组稍高、模型组最高（P＜0.05）；bFGF、TIMP-1 mRNA和蛋白相对表达量组间比较，BMSCs+bFGF组最高、BMSCs组其次、模型组稍低、假手术组最低（P＜0.05），提示转染-bFGF质粒的BMSCs对大鼠AMI再灌注损伤的保护作用可能与心肌组织bFGF水平上调、MMP-9/TIMP-1旁分泌机制有关。MMP-9属于锌离子依赖的内切蛋白水解酶家族重要成员之一，在心室重构中起关键作用[13]。TIMP-1是一种低分子量蛋白，含有N端和C端功能区，两端分别与MMP-9锌离子活性中心区及其他部位结合，形成非共价键复合物，阻断MMP-9与其相应底物结合，抑制细胞外基质降解[14]。生理状况下，MMP-9与TIMP-1间处于动态平衡状态，共同维持细胞外基质平衡，AMI再灌注时产生缺血再灌注损伤，MMP-9大量表达，心肌细胞外基质过度降解，大量炎性细胞在细胞间隙游走，TNF-α、IL-1β等炎症因子分泌增加[15]。移植转染bFGF基因的BMSCs后，一方面直接上调bFGF表达，另外BMSCs可通过旁分泌作用促进bFGF分泌，bFGF水平升高，促进心肌细胞外基质平衡，进而调节MMP-9与TIMP-1恢复平衡状态，细胞外基质代谢恢复正常，心肌组织炎症反应得以缓解，心肌组织微环境改善，减少心肌细胞凋亡，也利于干细胞定植和分化为类心肌细胞[16]。因而，转染-bFGF质粒的BMSCs对大鼠AMI再灌注损伤的保护作用可能与旁分泌机制有关。

综上所述，转染-bFGF质粒的BMSCs可显著改善AMI后再灌注大鼠的心功能、缓解炎症反应，并且可显著减少心肌细胞凋亡，可能与bFGF水平上调、调控MMP-9/TIMP-1旁分泌机制有关，为临床中利用干细胞移植治疗AMI再灌注损伤奠定理论基础。