走马胎抗肝癌活性部位的分离及其抗肝癌活性筛选*

贺珊, 廖长秀, 罗莹, 黄桂坤△

1右江民族医学院基础医学院(广西百色 533000)； 2右江民族医学院药学院, 右江流域特色民族药研究重点实验室(广西百色 533000)； 3广西肝胆疾病临床医学研究中心(广西百色 533000)

走马胎(ArdisiaGigantifolia)为紫金牛科(myrsinaceae)紫金牛属(ardisia)植物走马胎的干燥根茎，是广西民间应用较多的药物。有祛风湿、壮筋骨、活血祛瘀的功效，主治风湿筋骨疼痛、跌打损伤、产后血瘀和痈疽溃疡等[1-2]。目前从走马胎中提取分离得到的成分主要有：三萜皂苷类、岩白菜素及其衍生物和没食子酸及其衍生物等[3]，虽已有研究发现其中的三萜皂苷类成分对多种肿瘤细胞均有具有明显的抗肿瘤作用[4-8]，但走马胎中其他成分是否也对肿瘤细胞有抑制作用文献报道不多。2016年7月至2017年5月本课题以MTT法为导向，筛选不同走马胎提取组分中抗肝癌活性活性组分群，为走马胎抗肝癌研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株 人肝癌HepG2细胞购于中国科学院上海细胞生物研究所。

1.2 主要试剂 走马胎购于广西玉林中药材市场，由右江民族医学院覃道光副教授鉴定为走马胎根茎，乙醇、甲醇、正丁醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、冰醋酸均购于成都科龙化工试剂厂，D101大孔树脂购于天津市光复精细化工研究所，MCI凝胶购于日本三菱化工。胎牛血清、DMEM高糖培养基均购自Gibcol公司，胰蛋白酶、青链霉素混合液和MTT购于北京索莱宝科技有限公司。

1.3 主要仪器 细胞培养箱、酶标仪(美国Thermo公司)，圆底烧瓶、回流冷凝管、玻璃层析柱、烧杯、分液漏斗(天玻玻璃仪器有限公司)，真空旋转蒸发仪RE-3000A(上海亚荣生化仪器厂)，循环水式多用真空泵SHB-ⅢA(郑州长城科工贸有限公司)，冷冻干燥机(德国Christ公司)，分析天平(ME204E)(美国METTLER TOLEDO公司)，紫外分光光度计(日本岛津)

1.4 走马胎提取 称取走马胎药材330 g，粉碎后加入6倍量60%乙醇回流提取，回流3次，每次2 h，合并3次提取液，减压回收乙醇，并冷冻干燥为干粉，为制得的走马胎乙醇提取物。称重为29.645 g，干粉得率为8.98%。

1.5 走马胎醇提物抗肝癌活性部位的分离研究

1.5.1 水饱和正丁醇萃取 走马胎乙醇提取物加蒸馏水溶解，在分液漏斗中，用等体积的水饱和正丁醇进行萃取，至正丁醇层颜色变为无色。合并萃取的正丁醇层，减压回收正丁醇后，得走马胎正丁醇层萃取物浸膏。

1.5.2 D101大孔树脂分离及抗肝癌活性部位筛选 D101大孔树脂预装柱处理后，走马胎正丁醇萃取物加少量甲醇溶解后，上D101大孔树脂，静置待其充分吸收，分别用蒸馏水，30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和95%乙醇各3 000 mL进行洗脱，各部分洗脱液经减压回收乙醇和真空冷冻干燥机处理后得到干粉。不同洗脱部位最后所得干粉分别为1.105、1.017、2.281、2.06和0.921 g。

从液氮中复苏HepG2细胞，待长至培养瓶面积80%以上后，0.25%胰蛋白酶消化，用完全培养基将细胞悬液稀释到1×104·mL-1，以150 μL/孔接种于96孔培养基，每组设5个复孔。培养箱孵育24 h后，用二甲基亚砜(DMSO)溶剂将D101大孔树脂不同乙醇梯度的洗脱物分别配成浓度为10、20、40 mg/mL，用完全培养基稀释到浓度为10、20、40 μg/mL作用于肝癌细胞，此为加药组；对照组加入完全培养基(其中加与药液等体积的DMSO)。培养箱继续孵育72 h后，弃掉每孔上清液，各孔均加入含MTT溶液的培养基150 μL，放入培养箱孵育4 h，吸掉每孔上清液，每孔加入DMSO 150 μL，恒温振荡箱37℃振荡孵育10 min，酶标仪测各孔OD492值，按照以下公式计算细胞增殖的抑制率：

细胞增殖抑制率={[(实验孔OD492-空白孔OD492)-(对照孔OD492-空白孔OD492)]/对照孔OD492-空白孔OD492}×100%

1.5.3 MCI反相色谱柱分离及抗肝癌活性部位筛选 走马胎醇提物经D101大孔树脂洗脱后，体外抗肝癌活性成分主要集中在70%乙醇洗脱部位，进一步采用MCI法对70%乙醇洗脱组分分离筛选。称取走马胎70%乙醇洗脱物干粉1 g，加甲醇溶解后，加于MCI凝胶柱，待充分吸附后，分别用蒸馏水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇和100%甲醇进行洗脱，各部分洗脱液经减压回收得到干粉，称重分别为29.57、7.61、32.25、96.49和109.25 mg。

用DMSO溶剂将MCI凝胶柱不同甲醇梯度的洗脱物配成浓度为5、7.5、10、12.5、15 mg/mL，方法同1.2.2.2，药物用完全培养基稀释1 000倍后作用于肝癌细胞，计算细胞增殖的抑制率。

1.6 走马胎不同洗脱部位化学成分的研究

1.6.1 薄层色谱分析 采用硅胶薄层分析对走马胎D101大孔树脂和MCI硅胶柱的不同洗脱部位成分进行初步鉴定，取走马胎不同洗脱部位组分的粉末少许，甲醇溶解，用毛细管点样于硅胶G薄层板，以三氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶冰醋酸(4∶3∶3∶1)为展开剂，以50%硫酸乙醇为显色剂，记录各斑点颜色并计算Rf值。在同一块薄板上，同一条件下，各样品跑在相同位置上，Rf值相等，显相同颜色斑点(颜色深浅可不同)，提示这几种物质可能含有相同的成分，Rf=原点到斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。

1.6.2 紫外分光光度计测三萜皂苷含量 (1)波长选择：取0.1 mg/mL的齐墩果酸溶液和2.5 mg/mL的走马胎醇提物各0.2 mL加于比色管中，水浴挥发干溶剂，加入0.2 mL的香草醛冰醋酸溶液和0.8 mL的高氯酸，摇匀后置于60℃水浴15 min，取出迅速置于冰上冷却5 min，加冰醋酸5 mL摇匀。同时以相同量的香草醛-冰醋酸-高氯酸为空白，用紫外分光光度测最大吸收波长，齐墩果酸的最大吸收波长为545 nm，走马胎醇提物的最大吸收波长为550 nm，因此选择548(±2)nm为最大吸收波长。(2)标准曲线建立：取比色管8支，空白管1支同上，其余7支分别加入0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL齐墩果酸对照品溶液，方法同(1)，在548 nm波长处测定吸光度，得到吸光度与浓度的方程式为A=8.338 9c-0.032 4，r=0.995 7(n=7)。在20～90 μg范围内，齐墩果酸对照品的浓度和吸光度呈良好的线性关系。(3)走马胎不同洗脱物皂苷含量测定：取已配好的供试品溶液，每支比色管中加入0.2 mL，3支平行管，按照标准曲线的方法测量每组供试品的吸光度，然后根据线性方程计算三萜皂苷的含量，计算三萜皂苷在走马胎不同洗脱部位的含量百分比。

2 结果

2.1 走马胎醇提物经D101大孔树脂不同梯度洗脱物对HepG2细胞增殖的影响 走马胎体外抗肝癌HepG2细胞实验表明，走马胎醇提物对HepG2细胞有明显的抑制作用，抑制增殖的IC50为(260±0.158)μg/mL。进一步经D101大孔树脂进行层析分离并富集，可见D101大孔树脂不同乙醇梯度洗脱部位的产物，对肝癌细胞的增殖均有抑制作用。水洗脱物和30%乙醇洗脱物的抑制肝癌增殖作用较弱，50%乙醇洗脱物、70%乙醇物、95%乙醇洗脱物的作用相对明显，其中又以70%乙醇洗脱部位的抑制作用最为明显。见表1。

2.2 走马胎70%乙醇洗脱物经MCI后不同梯度洗脱物对HepG2细胞增殖的影响 进一步对走马胎70%乙醇洗脱部位进行分离纯化，经MCI凝胶柱层析分离后得70%甲醇洗脱部位对肝癌细胞增殖的抑制作用最强，与D101大孔树脂梯度乙醇洗脱产物的抑制活性相比，且其抑制肝癌活性较D101大孔树脂70%乙醇洗脱部位明显提高，抑制肝癌细胞增殖的IC50由(8.83±0.95)μg/mL提高到(8.30±0.92)μg/mL；而其他梯度洗脱所得产物的抑制活性较D101大孔树脂则有所减弱，说明进一步的MCI凝胶柱层析可使走马胎中抗肝癌活性组分得到更好的富集。见表2。

项目浓度(μg/mL)抑制率(%)IC 50(μg/mL)DMSO对照109.21±0.08148.95±2.23 水洗脱物2013.73±0.874023.70±2.6230%乙醇洗脱物101.10±0.21153.25±2.19202.47±0.52409.17±0.5550%乙醇洗脱物1026.55±3.0422.29±1.352032.05±2.794080.20±0.8170%乙醇洗脱物1049.58±1.618.83±0.952084.67±4.074085.72±0.0795%乙醇洗脱物1042.02±3.6515.94±1.202046.07±3.784079.69±4.55

项目浓度(μg/mL)抑制率(%)IC 50(μg/mL)DMSO对照组100.00±0.001138.37±3.06 水洗脱物202.67±1.18402.13±0.6830%甲醇洗脱物101.65±0.25-201.30±0.52402.00±0.5550%甲醇洗脱物1012.06±0.7074.88±1.882010.12±0.824052.80±2.2470%甲醇洗脱物1051.31±2.208.30±0.922081.71±4.664082.08±3.75100%甲醇洗脱物1033.12±6.5524.19±1.382042.75±0.934063.15±1.02

2.3 走马胎不同梯度洗脱物的硅胶薄层分析 50%硫酸乙醇显色后，在日光灯下显色为紫红色单一斑点，根据皂苷遇硫酸乙醇显色为紫色至紫红色的特性，说明走马胎醇提物、D101洗脱组分(水洗脱物、50%乙醇洗脱物、70%乙醇洗脱物、95%乙醇洗脱物)、MCI洗脱组分(水洗脱物、50%甲醇洗脱物，70%甲醇洗脱物、100%甲醇洗脱物)均含有皂苷类化合物；根据Rf值计算，以上组分的Rf值位置相同，颜色同现紫色，可能含有相同的组分；而D101 30%乙醇洗脱产物和MCI 30%甲醇洗脱产物显色为紫色，但硅胶板上斑点位置不同，说明它与走马胎其他梯度洗脱物中所含皂苷化合物种类有所不同。见图1。

A：走马胎醇提物经D101大孔树脂各梯度洗脱物(左为日光下，右为紫外灯下)，1为走马胎醇提物，2为水洗脱物，3为30%乙醇洗脱物，4为50%乙醇洗脱物，5为70%乙醇洗脱物，6为95%乙醇洗脱物；B:走马胎70%乙醇洗脱物经MCI凝胶柱后梯度洗脱物(左为日光下，右为紫外灯下)，1为走马胎70%乙醇洗脱物，2为水洗脱物，3为30%甲醇洗脱物，4为50%甲醇洗脱物，5为70%甲醇洗脱物，6为100%甲醇洗脱物

图1走马胎各梯度洗脱组分的硅胶薄层分析

2.4 走马胎不同梯度洗脱物三萜皂苷含量 由硅胶薄层分析可得走马胎不同梯度洗脱产物中均含有皂苷类化合物，为进一步明确走马胎活性组分中起抗肝癌活性的成分，以齐墩果酸为对照品，对走马胎各洗脱部位中总三萜皂苷的含量进行测定，D101大孔树脂30%乙醇洗脱物和MCI凝胶柱30%甲醇洗脱物总皂苷含量最高，分别为44.50%和48.79%，70%乙醇和70%甲醇洗脱部位总皂苷含量分别为35.50%和39.50%。见表3、图2。

图2 齐墩果酸标准曲线

3 讨论

在前期研究中已经证实走马胎水提物能明显抑制肝癌细胞的生长，诱导细胞凋亡。进一步对走马胎的抗肝癌活性部位进行筛选可知，走马胎醇提物经D101大孔树脂分离后，抗肿瘤活性最高的组分集中在70%乙醇洗脱部位，进一步用MCI凝胶柱进行分离和富集后，走马胎的抗肝癌活性主要集中在MCI凝胶柱70%甲醇洗脱部位，其对肝癌HepG2细胞的抑制率最高。

项目(D101)三萜皂苷含量(%)分组(MCI)三萜皂苷含量(%)水洗脱物15.26±0.10水洗脱物14.36±0.1130%乙醇洗脱物44.50±0.7830%甲醇洗脱物48.79±0.1650%乙醇洗脱物38.50±0.8850%甲醇洗脱物39.89±0.6570%乙醇洗脱物35.50±0.7170%甲醇洗脱物39.50±0.7195%乙醇洗脱物23.95±0.57100%甲醇洗脱物22.67±0.30

走马胎为紫金牛科紫金牛属植物走马胎的干燥根茎，目前从走马胎中分离出的化合物主要有三萜皂苷类、没食子酸类和岩白菜素类等[3]。皂苷类成分是目前研究的比较多的抗肿瘤活性成分之一，研究表明，走马胎中三萜皂苷成分对多种肿瘤细胞均有具有明显的抗肿瘤作用[4-5]。其中皂苷单体Ag3，其化学结构式为：3β-O-{α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-[β-D-吡喃木糖基-(1→2)]β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]α-L-吡喃阿拉伯糖基}-西克拉敏A。与它的生物转化产物损伤肝癌HepG2、SMMC-7721细胞的DNA，将细胞阻滞在S期，并进一步诱导肝癌细胞凋亡[6]，能将人乳腺癌细胞MCF-7细胞周期阻滞在S期，增加Caspase-3和Caspase-9表达的增加，启动线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡[7]，还可同时激活死亡受体途径和线粒体途径诱导鼠鼻咽癌细胞的凋亡[8]。本研究表明走马胎的主要抗肝癌活性组分70%乙醇和70%甲醇洗脱部位皂苷含量也较高(35.50%和39.50%)，提示三萜皂苷可能是走马胎主要抗肝癌活性组分之一，与以上文献报道一致。本研究也发现皂苷含量最高的30%乙醇(44.5%)和30%甲醇洗脱部位(48.79%)体外抗肝癌活性却较弱，薄层色谱也提示该部分的皂苷成分不同于70%乙醇和70%甲醇洗脱部位，提示并不是所有走马胎的皂苷化合物均有较强的抗肝癌活性，也可能存在皂苷以外的抗肝癌活性组分。

没食子酸又名五倍子酸，是一种有机酸，目前的研究发现，没食子酸和它的衍生物没食子酸酯具有明显的抗肿瘤活性，没食子酸可将人肝癌细胞SMMC-7721细胞周期阻滞在G0/G1期，通过抑制Akt活化、激活Caspase-9激活线粒体凋亡途径，诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡[9]，还可通过上调Bax，下调Bcl-2的表达激活Caspase-3和Caspase-9，诱导肝癌细胞凋亡[10]；其衍生物没食子酸酯类产物亦可通过阻滞细胞周期、诱导肝癌细胞凋亡、逆转肝癌细胞耐药等抑制肝癌细胞的增殖[11-13]。岩白菜素属于异香豆素类化合物，在紫金牛属植物中有较广泛的分布，岩白菜素具有显著的镇咳、镇痛、抗炎、增强免疫等作用，它的抗肿瘤作用较弱，但可通过调节谷胱甘肽和抑制氧自由基的释放来保护肝，具有显著的保肝作用[14-15]，可能在肝癌的恢复过程起一定的作用。此外，走马胎还有一些苯酚类和苯醌类化合物也有一定的抗肿瘤作用。

一种中药往往含有十几种甚至几十种具有生物活性的成分，因此抗肿瘤作用可能是全面而广泛的，不同抗肿瘤活性成分之间会产生协同、相加或拮抗作用。以上研究表明，走马胎的抗肝癌活性可能是由多种组分如三萜皂苷类、岩白菜素类和没食子酸及其衍生物等的共同作用。本研究得到的抗肝癌活性最高的70%甲醇洗脱部位中三萜皂苷类、岩白菜素类和没食子酸及其衍生物具体含量、成分和抗肝癌作用，有待利用色谱和质谱的方法进一步分离并结合MTT实验研究。