清道夫受体A启动子区DNA甲基化在同型半胱氨酸致动脉粥样硬化中的作用*

张靖， 张自新， 姜怡邓

1宁夏人民医院心血管内科(宁夏银川 750002)； 2宁夏医科大学总医院放疗科(宁夏银川 750004)； 3宁夏医科大学病理生理教研室(宁夏银川 750004)

动脉粥样硬化(AS)是一种以动脉粥样硬化斑块形成为主要特征的慢性增生性疾病，发生的机制包括内皮细胞的损伤、平滑肌细胞增生、泡沫细胞形成，其中泡沫细胞的形成发挥重要的作用。研究表明，高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia, HHcy)是AS的重要独立危险因子[1]。所谓同型半胱氨酸(Hcy),是体内一碳单位代谢的中间产物，其代谢途径主要有两种：转甲基途径和转硫途径。我们前期的研究[2]发现，Hcy可引起泡沫细胞脂质代谢异常进而促进AS发生发展，但其机制如何目前尚不清楚。清道夫受体 A(scavenger receptor classA, SR-A)是一种主要分布在巨噬细胞的表面的糖蛋白，巨噬细胞通过SR-A内吞修饰的脂蛋白，促进动脉粥样硬化斑块的形成[3]。但SR-A在AS中的表达调控机制尚不清楚。因此我们于2016年1月至2017年7月进行本研究，旨在探讨SR-A的表达水平改变及其启动子区DNA甲基化在Hcy致AS过程中的作用及其机制，为Hcy引起的AS相关疾病的诊疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠购自北京维通利华公司，小鼠为SPF级近交系C57BL/6J，均为雄性纯合子，5周龄。另选择健康5周龄雄鼠(SPF 级 C57BL/6J)作为对照组，对照小鼠购自宁夏医科大学实验动物中心。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物模型的复制及分组 本研究采用近交系C57BL/6J背景的5周龄雄性野生型小鼠和ApoE-/-小鼠(SPF级，北京维通利华公司)为研究对象。以C57BL/6J小鼠作为正常对照组(12只)：小鼠给予普通饮食；将ApoE-/-小鼠通过随机数表法分为两个组：(1)ApoE-/-对照组(12只)，小鼠饲以普通饮食；(2)高蛋氨酸组(12只)：小鼠饲以高蛋氨酸饮食(即向普通鼠用饲料中额外添加1.7%蛋氨酸)。

1.2.2 动物处理 在小鼠饲养16周后，禁食12 h后称重，待小鼠被成功麻醉后眼球取血静置以分离血清。随后将小鼠开腹并分离小鼠主动脉，用生理盐水清洗主动脉后迅速置于液氮中冷冻1 min，最后-80℃保存。

1.2.3 测定血清Hcy、LDL、HDL、TG、CH浓度 通过全自动生化分析仪检测各组小鼠血清当中的Hcy、胆固醇(cholesterol，CH)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)及三酰甘油(triglyceride，TG)浓度。

1.2.4 制备小鼠主动脉冰冻切片 将小鼠主动脉自冰箱中取出后，用干净的生理盐水冲洗后，自主动脉根部小心剪取1 cm。将取下的血管放在支承器上，滴上专用冷冻包埋剂冰冻固定、成型。将冷冻好的血管组织块固定后切成约5 μm的组织片，封片后油红O染色镜检。

1.2.5 THP-1单核细胞的复苏、传代及培养 从液氮罐中取出装有THP-1单核细胞(中原公司代购的美国ATCC)冻存管，完全融化，然后在无菌下取出细胞，加入适量培养液后轻轻吹打混匀为细胞悬液，后接种于6孔板中。置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。

1.2.6 细胞分组、处理及油红O染色 用含100 nmol/L佛波酯(PMA)的培养液干预细胞48 h后，显微镜观察THP-1单核细胞是否具有细胞贴壁、伸出伪足、形状不规则等巨噬细胞的相关特点。继续培养48 h后使巨噬细胞转化为泡沫细胞。更换为含有不同终浓度Hcy(50、100、200、500 μmol/L Hcy)和(或AZC)(50 μmol/L Hcy+10 μmol/L AZC)的培养液干预泡沫细胞，并同时设置培养基中不含有Hcy及AZC的正常对照组细胞，48 h后吸尽液体，PBS洗3次，加入试剂一应用液，盖上盖玻片，染色10～15 min，37℃温蒸馏水洗5～20 s；加入试剂二复染液，染色3～5 min，37℃温蒸馏水冲洗30～60 s，取出盖玻片，在盖玻片表面水干透之前滴加试剂三水性封固剂，封片后镜检。

1.2.7 cDNA第一链合成 按组分进行反应液的配制，轻柔混匀上述反应液，短暂离心使液体沉入管底后放入PCR仪中，42℃反应60 min，70℃ 5 min，停于4℃。得到的cDNA反应液可于-20℃条件下短期保存。将试剂置于冰上，配置反应体系，进行荧光定量PCR检测：在 NCBI GenBank数据库中查询LDLR(NM-001172633.1)采用Primer Premier 5.0软件设计引物，LDLR的引物：上游：5′-AGGAGCCCGAGTAAATTG-3′，下游：5′-CGGCAACAAGCAGAAGAA-3′，探针：5′-6-FAM-CCCCAGGAAACGGACCCT-TAMRA-3′，扩增产物长度为162 bp。GAPDH：上游：5′-GAGCTGAACGGGAAACTCAC-3′，下游：5′-GGTCTGGGATGG AAACTGTG-3′，扩增产物长度为146 bp。收集各组细胞，用TrizoI抽提总RNA，按反转录试剂盒说明书反转录合成cDNA，用以下条件进行PCR：94℃预变性3 min，94℃变性45 s，57℃退火45 s，72℃延长45 s，扩增35个循环。

1.3 数据处理

1.3.1 荧光定量PCR反应数据处理 荧光定量PCR反应数据结果计算公式：目的基因的相对量=2-ΔΔCt，ΔΔCt=[Ct (待测样品)-Ct GAPDH(待测样品)]-[Ct (校正样品)-Ct GAPDH (校正样品)]。

1.3.2 巢式降落式甲基化特异性PCR(nMS-PCR)检测SR-A启动子区DNA甲基化 巢式降落式甲基化特异性PCR(nested touch-down methylation-specific PCR, nMS-PCR)，是在甲基化特异性PCR(MS-PCR)的实验基础上加入了巢式降落式反应、并经过适当优化的一种基因甲基化程度检测技术。按DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，用亚硫酸盐修饰法对DNA进行甲基化修饰。采用网上在线(http：//www．urogene．org/methprimer/)和MethPrimer设计引物，LDLR外引物：上游：5′-TTAAAATGAAGTAAAAATTTTTTTT-3′，下游：5′-CCTTCATAAACTTAACCTTAAAATC-3′，PCR条件：30个循环(94℃，30 s；54.5℃， 30 s；72℃，1 min)，PCR产物长度：251 bp。甲基化上游：5′-AATAGTGGTTTTTTAAATATTTCGG-3′，甲基化下游：5′-TCATAAACTTAACCTTAAAATCGTC-3′；非甲基化上游：5′-AATAGTGGTTTTTTAAATATT-TTGG-3′，非甲基化下游：5′-TTCATAAACTTAA CCTTAAAATCATC-3′。反应条件：94℃预变性5 min，然后采用降落式PCR程序，30个循环(94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，1 min)，再于恒定的退火温度下进行20个循环(94℃，30 s；42℃， 30 s；72℃，1 min)，最后72℃再延伸10 min。甲基化产物为133 bp，非甲基化产物为134 bp，琼脂糖凝胶电泳，紫外线照像分析光密度。每组实验重复3 次。

1.3.3 结果计算与分析 采用软件自带Image Lab软件分析各条带光密度值，分析样品甲基化和非甲基化结果，结果计算公式为：甲基化百分比=甲基化(OD值)/[甲基化(OD值)+非甲基化(OD值)]。

2 结果

2.1 小鼠主动脉病理改变 油红O染色结果：正常对照组小鼠主动脉血管壁的三层结构清晰，且内膜光滑，平滑肌细胞排列整齐，内皮下未见脂质及炎性细胞浸润，中层及外膜结构清楚，未见病理改变；ApoE-/-对照组小鼠的主动脉管壁增厚，内膜增生，可见少量泡沫细胞形成；HHcy模型组小鼠主动脉粥样斑块形成，血管壁有隆起，内膜增厚，内膜下平滑肌细胞增生，管腔狭窄，有脂滴聚集，大量巨噬细胞浸润，中层结构紊乱，平滑肌增生、坏死，并有炎性细胞浸润。见图1。

A: 正常对照组; B: ApoE-/-对照组; C:高蛋氨酸组

2.2 小鼠血清Hcy及血脂含量 高蛋氨酸组小鼠血清当中的Hcy水平明显升高且高于ApoE-/-对照组和正常对照组小鼠，分别为两者的1.62倍和3.47倍，经统计学分析，3组比较差异均有统计学意义。高蛋氨酸组小鼠的血清LDL、TG、CH水平分别为ApoE-/-对照组的1.70倍、2.37倍和1.34倍，分别为正常对照组的3.62倍、8.28倍、7.24倍，HDL下降约32%和27.7%(P<0.05，P<0.01)，以上结果分析提示HHcy能够加重血脂代谢紊乱。见表1。

组别nHcy(μmol/L)LDL(mmol/L)HDL(mmol/L)TG(mmol/L)CH(mmol/L)正常对照组125.900±0.2600.396±0.0321.789±0.1830.197±0.0461.997±0.347ApoE-/-对照组1212.670±1.355∗∗0.843±0.158∗∗0.748±0.187∗∗0.689±0.176∗10.794±0.674∗∗高蛋氨酸组1220.475±4.947∗∗△△1.432±0.392∗∗△△0.475±0.098∗∗△1.632±0.586∗∗△△14.465±2.432∗∗△△

与正常对照组比较*P<0.05，**P<0.01；与ApoE-/-对照组比较 △P<0.05, △△P<0.01

2.3 小鼠主动脉SR-A表达改变 高蛋氨酸组小鼠的主动脉中SR-A mRNA表达水平为1.78±0.09，显著高于正常对照组和ApoE-/-对照组小鼠的相对表达量，分别为1.18±0.06和0.89±0.08，差异有统计学意义(与正常对照组比较t=3.383,P<0.05；与ApoE-/-对照组比较，t=5.621,P<0.05)；高蛋氨酸组小鼠的主动脉中蛋白表达水平为1.32±0.07，显著高于正常对照组和ApoE-/-对照组小鼠的相对表达量，分别为0.72±0.03和0.78±0.06，差异有统计学意义(与正常对照组比较t=3.254,P<0.05；与ApoE-/-对照组比较，t=4.579,P<0.05)。见图2。

A：各组小鼠主动脉中SR-A mRNA表达 B: 各组小鼠主动脉中SR-A 蛋白表达; *与高蛋氨酸组比较P<0.05

2.4 小鼠主动脉SR-A 启动子区DNA甲基化水平改变 采用生物信息学网站预测分析了SR-A启动子区的甲基化位点，见图3-A。高蛋氨酸组小鼠主动脉中SR-A启动子区DNA甲基化水平为0.47±0.05，显著高于对照组与正常对照组SR-A启动子区DNA甲基化水平，分别为0.32±0.02和0.30±0.04,差异无统计学意义(P>0.05)。见图3-B。

2.5 Hcy干预泡沫细胞后SR-A表达 不同浓度Hcy刺激泡沫细胞后，与正常对照组比较，SR-A mRNA和蛋白表达升高，但不呈剂量依赖关系，其中在50、100、200 μmol/L Hcy组SR-A mRNA 及蛋白水平显著升高(P<0.05)。见图4。

2.6 Hcy干预泡沫细胞后SR-A启动子DNA甲基化水平改变 分别用50、100、200、500 μmol/L Hcy干预泡沫细胞，通过nMS-PCR检测发现，Hcy并未引起SR-A启动子区甲基化水平改变。见图5。

2.7 腺病毒DNMT1感染泡沫细胞后SR-A启动子区DNA甲基化改变 构建DNMT1重组腺病毒载体并转染泡沫细胞，48 h后观察荧光效率，提取细胞总DNA，用nMS-PCR法检测SR-A启动子区DNA甲基化的变化，结果显示：DNMT1过表达后SR-A启动子区DNA甲基化水平0.67±0.02，DNMT1过表达合并100 μmol/L Hcy刺激后SR-A启动子区DNA甲基化水平0.62±0.05，两组差异无统计学意义(P>0.05)。见图6。

2.8 腺病毒DNMT1感染泡沫细胞后SR-A表达改变 构建DNMT1过表达并分别用腺病毒载体(空白对照组)和DNMT1重组腺病毒载体(过表达)感染泡沫细胞，48 h后提取细胞总RNA，检测SR-A mRNA和蛋白表达水平。结果表明：DNMT1过表达合并100 μmol/L Hcy刺激后SR-A mRNA表达水平为2.62±0.36， DNMT1过表达组0.42±0.06，空白对照+100 μmol/L Hcy组SR-A mRNA表达水平为3.82±0.43，前者分别与后两者比较差异有统计学意义(与DNMT1过表达组比较t=8.42,P<0.05；与空白对照+100 μmol/L Hcy组比较t=6.57,P<0.05),见图7-A。DNMT1过表达合并100 μmol/L Hcy刺激后SR-A蛋白表达水平为0.26±0.04， DNMT1过表达组0.05±0.01，空白对照+100 μmol/L Hcy组SR-A蛋白表达水平为0.38±0.03，前者分别于后两者比较差异有统计学意义(与DNMT1过表达组比较t=7.63,P<0.05；与空白对照+100 μmol/L Hcy组比较t=5.34,P<0.05)。见图7-B。

A：SR-A启动子区甲基化位点；B:nMS-PCR后样品琼脂糖凝胶电泳(M:甲基化条带,U:非甲基化条带)；C:SR-A甲基化统计图

图3ApoE-/-小鼠主动脉SR-A启动子区DNA甲基化水平

A:泡沫细胞SR-A mRNA表达；B: 泡沫细胞SR-A蛋白表达；*与正常对照组比较 P<0.05； #与50 μmol/L Hcy组比较 P<0.05

A：SR-A启动子区DNA甲基化电泳图；B：SR-A启动子区DNA甲基化水平统计图

A：SR-A启动子区DNA甲基化电泳图；B：SR-A启动子区DNA甲基化水平统计图

A：DNMT1腺病毒感染泡沫细胞后SR-A mRNA表达；B：DNMT1腺病毒感染泡沫细胞后SR-A蛋白表达，*与空白对照组比较P<0.05， #与DNMT1过表达组比较P<0.05， △与空白对照+100 μmol/L Hcy组比较P<0.05

图7DNMT1腺病毒感染泡沫细胞后SR-A的表达改变

2.9 SR-A甲基化对泡沫细胞形成的影响 Hcy可以增加细胞泡沫样改变，镜下泡沫细胞的形状不规则，胞浆内充满大量红色脂质颗粒，状如脂滴，且有部分细胞因吞噬脂质导致细胞体积明显增大；而在加入AZC之后，结果显示AZC明显促进了Hcy引起的泡沫细胞内的脂质聚积这一作用。见图8。

A: 正常组泡沫细胞形态；B: 50 μmol/L Hcy干预后的泡沫细胞形态改变; C:AZC干预后泡沫细胞形态改变

3 讨论

血管壁受到高浓度的糖、脂类等刺激后，就会产生慢性炎症反应[4]，使血液中的单核细胞向病变部位浸润，细胞伸出伪足并分化为巨噬细胞，巨噬细胞在吞噬大量脂质后变为泡沫细胞[5]。大量泡沫细胞堆积在血管内膜下形成动脉粥样斑块，这是动脉粥样硬化相关疾病发生的关键环节。高血脂、高血糖、高血压、吸烟等已被确认为AS的危险因素[6]。有研究表明，体内Hcy水平升高，AS的发病率及死亡率明显上升，因此，HHcy被视作AS的独立危险因素[7]。当血清当中Hcy水平>5 μmol/L，发生心血管疾病的危险性增加20%～30%；但将Hcy水平维持在9 μmol/L以下，心血管疾病5年存活率可达95%；如果血清Hcy水平持续在9～15 μmol/L之间时，心血管疾病5年存活率大约为90%；当血清Hcy水平达到16～20 μmol/L时，5年存活率低于75%[8]。目前认为，Hcy致病机制与其代谢途径密不可分[9]。首先，Hcy在体内是甲硫氨酸循环的中间产物，因此，当摄入的蛋氨酸水平增加时，可能会导致Hcy水平升高，从而促进疾病的发生发展[10]。

SR-A是一种位于吞噬细胞表面的糖蛋白,能够参与免疫系统的病原体识别与清除活动，同时还可清除丧失唾液酸的陈旧红细胞以及循环中的某些凋亡细胞[11]。还有学者发现SR-A 能够作为脂蛋白受体从而参与AS的发生发展[12]，这一结果在一定程度上为临床治疗和干预指明了方向，本研究表明，相比对照组，给予高蛋氨酸饮食喂养的ApoE-/-小鼠主动脉当中SR-A的mRNA及蛋白表达水平均出现显著上调，且细胞水平的实验结果与动物水平一致。这就提示Hcy可促进SR-A表达，故Hcy有可能通过增加SR-A的表达水平促进了脂质的胞内沉积并最终加速AS的发展。

DNA甲基化是表遗传学领域的关键内容之一，有学者先后发现，在AS的进展过程中，氧化低密度脂蛋白受体、二甲基精氨酸二甲氨基水解酶等多种基因的DNA甲基化程度均出现了明显的变化[13]。在前期研究中，课题组发现Hcy能够下调DNMT1的表达水平并影响下游基因的DNA甲基化水平[14]。

综上所述，Hcy可能通过调控SR-A启动子区的DNA甲基化从而改变表达水平，增加泡沫细胞中的脂质聚集并加速AS的发生发展，为AS的分子生物学诊断提供新的视角。