凡纳滨对虾烂尾病病原的分离鉴定及药敏分析

黄雪敏，梁华芳，薛 明，余文智，李成聪，陈 耀，温崇庆



凡纳滨对虾烂尾病病原的分离鉴定及药敏分析

黄雪敏，梁华芳，薛 明，余文智，李成聪，陈 耀，温崇庆

（广东海洋大学水产学院，广东 湛江 524088）

【目的】研究广东湛江地区凡纳滨对虾（）烂尾病主要病原及其药敏特征。【方法】从对虾病灶部位分离纯化细菌，用2株代表菌株对健康虾进行创伤浸浴感染试验，分析菌株形态特征、生理生化特征以及16S rRNA和基因序列，以哈维氏弧菌（）和坎氏弧菌（.）溶血素基因特异引物扩增菌株基因组DNA，通过纸片扩散法测试菌株对17种药物的敏感性。【结果】从患病亲虾和养殖对虾分别分离获得编号2018B22和2018MZ1的代表菌，两株菌16S rRNA和基因序列均与哈维氏弧菌最相似，且均可被哈维氏弧菌溶血素基因引物特异扩增，表型特征亦与哈维氏弧菌相近；两株菌均可引起凡纳滨对虾烂尾病，其中菌株2018B22的致病力较2018MZ1更强，而后者的耐药谱更广。【结论】湛江地区凡纳滨对虾烂尾病主要病原为哈维氏弧菌。

凡纳滨对虾；烂尾病；哈维氏弧菌；鉴定；药敏试验

凡纳滨对虾（）是我国乃至世界最主要养殖虾种。随着集约化养殖的发展，细菌性病害频发，给凡纳滨对虾产业造成巨大经济损失。对虾细菌性病害多由弧菌引发，从孵化期到成虾均经常发生，主要包括黄鳃病、黑鳃病、红腿病、肌肉白浊病、白黑斑病、幼体发光病及败血症[1-2]，以及急性肝胰腺坏死综合征等[3]。已报道的对虾弧菌病病原有哈维氏弧菌（）、副溶血弧菌（）、坎氏弧菌（）和溶藻弧菌（）等[1-3]十多种。

对虾烂尾病在养殖生产中虽时有发生，但仅林延川等[4]简要介绍凡纳滨对虾烂尾病病症、可能原因和治疗措施，鲜见该病病原及其药物敏感方面的报道。2018年4―7月，广东湛江地区一些凡纳滨对虾繁育场的亲虾及养殖场的对虾在养成期间出现大批烂尾现象，其中亲虾发病症状比养殖对虾更为严重，甚至造成大量亲虾死亡。本研究针对湛江地区出现的凡纳滨对虾烂尾病开展细菌分离鉴定、致病性和药物敏感性研究，为对虾烂尾病防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验对虾 患病凡纳滨对虾亲虾和养殖对虾分别取自广东湛江市徐闻县某对虾繁育场和湛江市麻章区某对虾养殖场，亲虾体质量（35.4±5.2）g，养殖期对虾体质量（4.8±0.5）g。发病对虾主要症状为腹部最后2体节、尾扇有多处发黑病灶，尾扇肿胀、边缘溃烂，甚至因溃烂导致尾扇残缺（图1）。发病初期对虾活力和摄食正常，症状严重时游动和摄食明显减少，活力下降。

攻毒用健康凡纳滨对虾取自湛江市东海岛广东海洋大学养殖基地养殖对虾，体质量（0.9±0.4）g。

1.1.2 试剂、引物和菌株 2216E琼脂培养基：蛋白胨 5 g，酵母粉 1 g，FePO40.01 g，琼脂粉 18 g，陈海水 1 L，pH 7.6 ~ 7.8；TCBS琼脂培养基（CM402），北京陆桥技术公司产品；MH琼脂培养基（B163）和药物纸片为杭州滨和微生物试剂有限公司产品。API 20E生化鉴定试剂条及其配套试剂，梅里埃公司产品；细菌DNA提取试剂盒（DP302），天根生化科技公司产品；Taq DNA 聚合酶（R001B）和pMD19-T载体（6013），Takara公司产品。所用引物均由上海生工生物公司合成。

箭头示主要发病部位

The main infection focuses are indicated by arrows

图1凡纳滨对虾亲虾（A）和养殖个体（B）烂尾病症状

Fig. 1 Symptoms of tail-rotted disease offrom broodstocks (A) and cultured individuals (B)

大肠杆菌（）DH5α和ATCC 25922为广东海洋大学水产学院微生物学实验室保存，分别用于转化实验感受态细胞制备和药敏试验参考菌株。

1.2 病原菌分离

分别取有典型烂尾症状的凡纳滨对虾亲虾、养殖期对虾各3尾，无菌海水冲洗虾体3遍，用接种环蘸取尾扇病灶组织分别于2216E及TCBS琼脂平板上划线，于30℃条件下培养2 d，取优势菌落于2216E平板纯化，获得纯培养斜面后加石蜡油于15℃下保存，备用。

1.3 人工感染

选取暂养2 d的无外伤、活力强的健康凡纳滨对虾进行人工浸浴感染试验。分别取分离自发病亲虾和养殖对虾的代表菌各1株，用2216E培养基在30 ℃、160 r/min条件下振荡培养12 h，离心收集菌体，用无菌海水漂洗2次，用无菌海水将细菌稀释至1×1010cfu/mL。试验设2个感染组及1个对照组，每组设3个重复组，在25 L食品级塑料桶中进行。每桶含经体积分数20×10-6甲醛消毒12 h，再曝气处理24 h的海水10 L，投放被无菌针扎刺尾扇两次的对虾10尾。感染组分别加入相应的菌悬液5 mL，每天1次，连续4 d；对照组不加菌。试验期间连续充气，日换水20%，每8 h投喂配合饲料1次，室温（24～27℃）下养殖10 d，每天观察记录各组对虾发病情况，试验结束时对感染发病对虾进行病原菌再分离。

1.4 细菌鉴定

1.4.1 形态和生化试验 将两株代表菌分别于2216E和TCBS琼脂培养基划线培养（30℃），观察记录菌落特征。按常规方法对两株菌进行革兰染色和细胞大小测定，生理生化试验主要采用API 20E生化鉴定试剂条按其使用说明操作，同时测定两株菌对弧菌抑制菌0/129的敏感性。

1.4.2 16S rRNA和基因测序和分析 按操作说明提取两株菌的基因组DNA。以引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）对两株菌进行16S rRNA基因PCR扩增，参考文献[5]方法，以引物H60F[6]（5′-GGNGAYGGNACNACNACN GCN CANGT-3′）和H60R（5′-TCNCCRAANCCNGGN GCYTTNACNGC-3′）进行基因扩增。PCR反应体系均为50 μL，含10×PCR buffer 5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）各1 μL，引物（20 μmol/L）0.5 μL，基因组DNA 5 μL（约25 ng），Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，以ddH2O补足体积。用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。对16S rRNA基因扩增产物纯化后直接通过27F和1492R引物双向测序，再拼接完整；基因扩增产物纯化后通过pMD19-T载体连接并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性转化子进行目的片段测序。测序均委托华大基因广州分公司通过ABI 3730XL测序仪完成。

将测得的16S rRNA基因序列与EzBioCloud数据库（https://www.ezbiocloud.net/）模式菌株进行比对，以确定其可能种属信息。对于基因序列，通过NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行序列比对，从中调取与代表菌株最相似几种弧菌尤其是模式菌株HSP60序列，用MEGA 7软件构建基因系统发育树。

1.4.3 溶血素（）基因检测 参考Haldar等[7]方法，分别以哈维氏弧菌溶血素基因特异性引物（Vh-hly1F：5′-GAGTTCGGTTTCTTTCAAG-3′，Vh-hly1R：5′-TGTAGTTTTTCGCTAATTTC-3′）和坎氏弧菌溶血素基因特异性引物（Vca-hly5：5′-CTATTGGTGGAACGCAC-3′，Vca-hly3：5′-GTA TTCTGTCCATACAAAC-3′），对两株代表菌基因组DNA进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

1.5 药敏试验

参考曾德乾等[8]方法，用纸片扩散法（Kirby-Bauer法），以大肠杆菌ATCC 25922为参考菌株，检测两株代表菌对17种药物的敏感性。取100 μL 浓度约108cfu/mL菌悬液涂布于含20 mg/mL NaCl的MH琼脂平板，贴上药敏纸片，每株菌每种试纸做2次重复，于28℃条件下倒置培养24 h，记录抑菌圈直径，取平均直径，参考文献[9]方法判定测试菌株的药物敏感性。

2 结果

2.1 细菌分离

从患病亲虾（图1A）和养殖对虾（图1B）各分离到一株优势代表菌，分别编号为2018B22和2018MZ1。

2.2 人工感染

分离菌株2018B22和2018MZ1均可引起凡纳滨对虾烂尾病，发病率分别为（40±10）%、（16.7±11.5）%，其中2018B22感染组不仅发病率较高，发病对虾烂尾程度较严重，有2尾对虾严重感染死亡；2018MZ1感染组发病个体烂尾症状相对较轻，试验期间无死亡个体；而对照组在试验后期仅有1尾对虾尾扇表现轻微症状。从感染组病虾尾扇处再次分离到与实验菌株特征一致的菌株，表明菌株2018B22和2018MZ1为烂尾病的病原菌。

2.3 细菌鉴定

2.3.1 形态特征 分离菌株2018B22和2018MZ1均为革兰阴性，短杆状，分散排列，可运动，细胞大小分别为（0.5 ~ 0.9）μm ×（0.9 ~ 2.8）μm和（0.4 ~ 0.8）μm × （0.8 ~ 1.7）μm。2018B22和2018MZ1在2216E平板30℃下培养24 h的菌落均为圆形、表面光滑、湿润、淡黄色，直径分别约为1.8 ~ 2.5 mm和4 ~ 5 mm；在TCBS平板菌落均为圆形、较光滑、黄色、边缘规整，直径1 ~ 2 mm。两株菌在2216E和TCBS平板上的菌落均无可见荧光。

2.3.2 生理生化特征 菌株2018B22和2018MZ1对弧菌抑制菌0/129（150 μg /片）均显示敏感但敏感性较弱。表1可见，2株菌20项生化试验结果均一致。与弧菌科菌种[10]相关特征相比，两株菌生理生化特征与哈维氏弧菌均较一致。

表1 菌株201B22和2018MZ1的API 20E试验结果

注：＋、－、d、NO 分别表示阳性、阴性、可疑和无记录。

Note: ＋, －, d , and NO indicate positive, negative, dubious results, and no data, respectively.

2.3.3 16S rRNA基因序列分析 菌株2018B22和2018MZ1的16S rRNA基因测序拼接后有效序列长度分别为1 424、1 399 bp，两者仅有2个碱基差异，GenBank登录号分别为MK318662和MK318661。EzBioCloud数据库比对结果显示，菌株2018B22和2018MZ1的16S rRNA基因均与哈维氏弧菌模式菌株NBRC 15634T最相似，但分别与表2的其他弧菌模式菌株的相似性也较高（≥98.5%）。

表2 菌株201B22和2018MZ1与模式菌株16S rRNA基因序列的相似性

2.3.4基因序列分析 两株菌基因经克隆子测序后，有效序列均为541 bp，两者有6个碱基差异，相似性98.89%。NCBI 比对显示两株菌均与包括模式菌株在内的多株哈维氏弧菌基因序列相近，相似性均超过98.7%，在系统发育树上聚为一独立分支（图2），并与其他几种弧菌明显分开，与其序列相似性均不到97.5%。从基因同源性上看，2018B22和2018MZ1极可能是哈维氏弧菌。

2.3.5基因检测 图3可见，哈维氏弧菌基因特异引物对两株菌均扩增出约500 bp特异条带，与目的片段大小一致，而坎氏弧菌基因特异引物除从阳性对照扩增出约300 bp目的片段外，对两株菌的扩增结果均为阴性，进一步表明两株菌极可能是哈维氏弧菌，排除为坎氏弧菌的可能。综合形态和生理生化特征、16S rRNA与基因测序分析和基因检测结果，确定菌株2018B22和2018MZ1均为哈维氏弧菌。

2.4 药敏试验

如表3所示，在17种抗菌药物中，菌株2018B22对诺氟沙星、复方新诺明和氯霉素等8种药物表现敏感，对氨苄青霉素等4种药物呈耐药性；菌株2018MZ1仅对诺氟沙星、复方新诺明和氯霉素表现敏感，对呋喃唑酮等8种药物呈耐药性。可见两株菌对药物敏感性有较大差异，但均对诺氟沙星、复方新诺明和氯霉素敏感，同时均对氨苄青霉素、阿莫西林、多黏菌素B和四环素表现耐药性。

括号内为序列在GenBank中的登录号The sequences accession numbers in GenBank were shown in parentheses

M: DNA标准；1-3分别为Vh-hly引物扩增阴性对照、2018MZ1和2018B22；4-7分别为Vca-hly引物扩增产物阴性对照、2018MZ1、2018B22和阳性对照

M: DNA marker; 1-3 indicated the amplification of negative control, 2018MZ1, and 2018B22 with Vh-hly primers, respectively; 4-7 indicated the amplification of negative control, 2018MZ1, 2018B22, and positive control with Vca-hly primers, respectively

图3基因PCR扩增产物

Fig. 3 PCR amplified products of hly gene

3 讨论

迄今，鲜见有关对虾烂尾病的报道，尤其缺乏该病病原的资料。本研究凡纳滨对虾烂尾病症状与林延川等[4]报道的相似。林延川等[4]认为其病因是水质恶化和对虾体质下降时细菌感染所致，但具体病原未作描述。本研究表明，2018年春夏季湛江地区凡纳滨对虾烂尾病主要由哈维氏弧菌引起，但两株病原菌的致病力不同，其中亲虾分离株致病力明显强于养殖对虾分离株，与其最初分离病虾的烂尾程度一致。哈维氏弧菌是海产动物最常见病原菌之一，也是条件致病菌，广泛分布于海水养殖环境，可引起对虾多种病症[2, 11-12]。哈维氏弧菌对水产动物的致病机制目前还不完全清晰，但其溶血素、蛋白酶和几丁质酶等胞外产物被认为是重要毒力决定因子[11]。细菌毒力基因表达水平会随环境条件而变化，Montánchez等[13]研究表明，温度升高促进了哈维氏弧菌毒力基因表达并增强其致病性。本研究和林延川等[4]报道的凡纳滨对虾烂尾病均发生在夏季，夏季养殖水温升高极可能与该病发生密切相关，具体致病机制仍需进一步研究。

表3 药敏试验结果

注：R，耐药；I，中介；S，敏感

Notes: R, Resistant；I, Intermediate；S, Sensitive

哈维氏弧菌通常可发荧光[10-11]，引起对虾病害的哈维氏弧菌多数情况下可发荧光[11, 14]，但本研究两株分离菌菌落均未发荧光。Defoirdt等[15]发现，哈维氏弧菌不同菌株间荧光强弱差异明显，但与其对卤虫（）幼体毒性关系不大。Zhou等[14]从患白尾病的凡纳滨对虾病灶中分离到一株高毒力非荧光的哈维氏弧菌。可见哈维氏弧菌致病性强弱与其是否发光与并无直接关系。

细菌的准确鉴定需结合表型和分子特征。本研究中，两株分离菌的细胞和菌落大小均略有不同，两株菌的致病力差异较大，但表型上均与哈维氏弧菌相近。细菌分子鉴定中最常用方法是16S rRNA基因序列分析，16S rRNA基因进化保守，可对细菌进行属水平上的鉴定。本研究中，二菌株与包括哈维氏弧菌在内的多种弧菌16S rDNA序列相似性均达98.5%以上，仍需借助其他方法进一步鉴定。哈维氏弧菌与坎氏弧菌常引起对虾病害[2, 11-12]，两者表型与基因型特征较相似，常被相互错误鉴定[2,10,12]。基因编码细菌60 ku热休克蛋白，在细菌基因组中常以单拷贝存在，进化速度快于16S rRNA基因，适用于鉴别亲缘关系相近的细菌[5]。本研究两株分离菌基因序列均与哈维氏弧菌的最为相似，系统进化树上聚为一类，与包括坎氏弧菌在内的其他弧菌模式菌株明显分开，序列相似性也较低，可见基因序列可有效区分亲缘关系相近的弧菌。基因在同种弧菌中具高度保守性，可用于弧菌种水平上的特异性检测[5-6]，本研究两株分离菌均可被哈维氏弧菌基因引物扩增，而未被坎氏弧菌引物扩增，进一步明确两株菌是哈维氏弧菌，而排除坎氏弧菌的可能性。

本研究鉴定的两株哈维氏弧菌可能因分离源不同，对抗菌药物的敏感性有较大差异，但两者均对诺氟沙星、复方新诺明和氯霉素敏感，而对氨苄青霉素、阿莫西林、多黏菌素B和四环素耐药。童国忠等[16]、梅冰等[17]和姚欢等[18]分别报道了海水网箱养殖大黄鱼（）（浙江舟山）、斜带石斑鱼（）（海南三亚）和眼斑拟石首鱼（）（广东湛江）烂尾病的病原均为哈维氏弧菌，这些病原菌菌株除对四环素敏感性不一致外，对诺氟沙星、复方新诺明和氯霉素均表现敏感，而对氨苄青霉素、阿莫西林和多黏菌素B有耐药性。刘迪等[19]对10株分离自上海、浙江、福建和海南养殖凡纳滨对虾的哈维氏弧菌药敏试验结果也与此一致。曾德乾等[7]对源自南海沿岸患病鱼类的84株哈维氏弧菌耐药性测试也获得相似结果，所有菌株均对诺氟沙星敏感，对复方新诺明和氯霉素表现敏感的菌株也分别约占90%和80%，对阿莫西林耐药率高达90.5%。以往研究和本研究均表明，中国东南沿海不同时空养殖环境分离的多数哈维氏弧菌对诺氟沙星、复方新诺明和氯霉素敏感，而对阿莫西林、氨苄青霉素和多黏菌素B呈现耐药性。尽管本研究两株哈维氏弧菌均对诺氟沙星、复方新诺明和氯霉素敏感，且菌株2018B22还对另外5种药物敏感，然而这些敏感药物目前均为渔业禁药。因此，对哈维氏弧菌所致对虾烂尾病或其他水产病害的防治，在保持良好养殖环境的同时，需探索非药物的绿色途径。

综上，本研究结合表型和分子方法确定，2018年春夏季湛江地区凡纳滨对虾烂尾病主要病原为非发光哈维氏弧菌，两株不同分离源哈维氏弧菌的致病力和药物敏感性均呈现明显差异。这些结果可为对虾烂尾病的研究和防治提供参考依据。

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Identification and DrugSensitivity Test of Pathogen Isolated fromAssociated with Tail-Rotted Disease

HUANG Xue-min, LIANG Hua-fang, XUE Ming, YU Wen-zhi, LI Cheng-cong, CHEN Yao, WEN Chong-qing

（,,524088,）

【Objective】To study the main pathogen and drug sensitivity associated with tail-rotted disease ofin Zhanjiang, Guangdong Province. 【Methods】Bacteria were isolated from lesion locations of the diseased shrimps, and two representative strains were first tested for artificial infection of healthy shrimps by wound immersion. Then they were identified by morphological, physiological and biochemical characteristics, and were further studied by sequencing analysis of 16S rRNA and HSP60 genes, as well as amplifying with hemolysin gene-specific primers forand. Finally, the sensitivities of the strains to 17 kinds of drugs were examined by disc diffusion method. 【Results】Two representative strains, 2018B22 and 2018MZ1, were isolated from the diseased broodstock and cultured individually. They were most phylogenetically affiliated with.based on sequence similarity of 16S rRNA and HSP60 genes, and both of them could be specifically amplified by the hemolysin gene-specific primers of, and had similar phenotypic characteristicsto those of.. Both strains could cause tail-rotted disease of., and strain 2018B22 was more pathogenic than strain 2018MZ1, while the latter had a broader spectrum of drug resistance. 【Conclusion】was the main pathogen causing tail-rotted disease ofin the Zhanjiang area.

; tail-rotted disease;; identification; drug sensitivity test

S917.1; S945.1

A

1673-9159（2019）04-0042-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.04.007

2019-02-17

国家自然科学基金项目（31502189）；广东海洋大学2019年度创新强校专项资金（230419095）

黄雪敏（1994—），女，硕士研究生，研究方向为海洋和水产微生物学。

温崇庆（1974—），男，教授。 E-mail: chongqingwen@163.com

黄雪敏，梁华芳，薛明，等. 凡纳滨对虾烂尾病病原的分离鉴定及药敏分析[J]. 广东海洋大学学报，2019，39（4）：42-48.

（责任编辑：刘庆颖）