尼罗罗非鱼Galectin-3基因的原核表达与条件优化

罗国玲，牛金中，黄 瑜，汤菊芬，蔡双虎，简纪常



尼罗罗非鱼Galectin-3基因的原核表达与条件优化

罗国玲，牛金中，黄 瑜，汤菊芬，蔡双虎，简纪常

（广东海洋大学水产学院 / 广东省水产经济动物病原生物及流行病学重点实验室，广东 湛江 524088）

【目的】对Galectin-3蛋白进行纯化，优化诱导相关表达条件，为大量获取罗非鱼Galectin-3蛋白提供方案。【方法】根据NCBI上已公布的罗非鱼（）Galectin-3基因序列，设计多对带RI和l酶切位点的引物，筛选出良性扩增引物，对罗非鱼cDNA经进行聚合酶链式反应（PCR）扩增、限制性快切酶双酶切、T4连接酶连接等步骤，构建罗非鱼Galectin-3基因的原核表达质粒pGEX-4T-Galectin-3，将重组质粒导入大肠杆菌BL21中，进行Galectin-3重组蛋白的表达。并比较不同的诱导温度、诱导时间、IPTG浓度条件下的表达效果，对Galectin-3蛋白表达最优条件进行筛选。【结果】构建了罗非鱼Galectin-3原核表达质粒，进行Galectin-3重组蛋白后发现37 ℃下，0.4 mmol/L浓度的IPTG诱导5 h即可诱导Galectin-3重组蛋白高效表达。免疫印迹结果显示，经蛋白纯化柱纯化后的pGEX-4T-Galectin-3重组蛋白可与GST-Tag单克隆抗体发生特异性反应，进而表明表达的重组蛋白是罗非鱼的Galectin-3蛋白。【结论】本研究成功构建了罗非鱼Galectin-3基因的原核表达载体，并确定了Galectin-3融合蛋白最适的表达条件：37 ℃下，0.4 mmol/L浓度的IPTG诱导5 h。

尼罗罗非鱼；半乳糖凝集素-3；原核表达；条件优化

凝集素（Lectin）是脊椎动物中具有多种功能的原始分子。在免疫功能方面，凝集素通常能直接参与抵御病原侵入机体、参与免疫调节或炎症反应，通过与各种感染性物质的表面结合后，进行凝集细胞，沉淀多糖和复合碳水化合物等作用[1-2]。半乳糖凝集素（Galactin，S型动物凝集素）是一种多价蛋白质，具有识别和结合多种碳水化合物结构的能力。这些蛋白质至少有一个保守的糖识别区域（Carbohydrate Recognition Domain，CRD），其中约有130个氨基酸，并依据CDR的识别分为3类：原型、嵌合体型、衔接重复型。目前，已分离并确定了16个Galactins家族的成员，半乳糖凝集素是一种嵌合体型半乳糖凝集素。

尼罗罗非鱼（）是我国南方最重要的经济养殖鱼类[4]，然而，近几年来无乳链球菌病对罗非鱼养殖业造成了巨大损失，严重影响了罗非鱼产业的健康发展[5]，因此对罗非鱼的防御机制的深入研究非常迫切。已有研究表明，Galectin-3可以调节T细胞的生长和凋亡[6]，且在巨噬细胞活化过程中发挥重要作用[7]。目前，鱼类半乳糖凝集素在鱼类免疫系统中的研究尚处于起步阶段，对其凝集素家族的研究已获得半乳糖凝集素3的基因全长，对其转录及表达水平进行了研究[2]，但还未见其蛋白水平的相关研究报道。

目前大肠杆菌表达体系已广泛应用于各种外源基因的表达，但并非每一种基因都能在其体内表达，且基因的表达受宿主菌种类，菌体培养温度，诱导时细菌生长密度及诱导剂种类、浓度和诱导时间[9]等多种因素影响，表达效率差异很大[8]。因此，本研究通过构建Galectin-3基因的原核表达载体，并将其转入到大肠杆菌原核表达体系中，进行Galectin-3重组蛋白的表达，并选取了可提高目标蛋白活性和可溶性的BL21大肠杆菌作为宿主菌[10]及与乳糖相比，诱导效率更高的异丙基硫代半乳糖（IPTG）诱导剂[11]，对诱导温度、IPTG浓度和诱导时间等表达条件进行优化，并对Galectin-3蛋白进行纯化，为大量获取罗非鱼Galectin-3蛋白提供方案，以期为后续制备单克隆抗体及进一步研究鱼类凝集素功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用罗非鱼购于广东省湛江市湖光镇周边养殖场；pMD18-T克隆载体、DL2000DNA分子标准购自TaKara公司，RNA提取试剂盒、切胶回收试剂盒、蛋白分子标准及DH5α、BL21感受态细胞购自TRANS公司；质粒提取试剂盒由Thermo scientific公司提供；原核表达载体pGEX- 4T（+）Vector由广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 罗非鱼Galectin-3基因片段的扩增 于无菌操作台上摘取罗非鱼的脾脏组织，液氮研磨法研磨组织，于无RNA酶操作环境下依照RNA提取说明书进行罗非鱼RNA的提取。琼脂凝胶电泳检测RNA质量符合要求（条带单一）后，按照反转录RT-PCR说明书将RNA反转录成cDNA。根据NCBI上公布的罗非鱼Galectin-3的基因序列（基因号：NC_031980.2）进行引物的设计。设计引物GF：CCGGAATTCGACCTCTCAGACGCTC，GR:CCGC TCGAGGGGCATCATCTCCAT。以反转录合成的cDNA为模板，采用20 μL体系进行PCR扩增：rTaq Mix：10 μL、ddH2O：7 μL、引物（GF/GR）：1.0 μL、cDNA：1 μL，离心混匀后，实施PCR。PCR扩增程序为预变性：95 ℃ 5 min；变性：95 ℃ 30 s；退火：55 ℃ 30 s；延伸：55 ℃ 45 s；36个循环；循环结束后终延伸：72 ℃ 5 min。扩增产物经琼脂凝胶电泳检测，依照PCR产物切胶回收试剂盒说明书进行DNA的切胶回收得到纯化的PCR产物。纯化的PCR产物与pMD18-T克隆载体在16 ℃条件下连接12 h，将连接产物转入DH5α感受态细胞中，涂板接种到带氨苄抗性的琼脂培养基上，37 ℃培养 12 h后，使用载体上的通用引物M13-RV：GAG CGG ATC ACA ATT TCA CAC AGG和M13-47（-）：CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC，进行菌落PCR鉴定，选取阳性克隆菌液送至上海生工测序部测序。

1.2.2 原核表达载体的构建 对测序比对结果正确的pMD-18-Galectin-3重组质粒及pEGX-4T空质粒根据GeneJET Plasmid Miniprep Kit说明书进行质粒提取。将重组质粒和空质粒使用限制性内切酶R1和I 分别进行双酶切操作，在37 ℃条件下酶切2 h，同样使用琼脂凝胶电泳法对酶切产物进行产物纯化处理。纯化后的酶切产物在25~30 ℃下使用T4连接酶连接12 h，将连接产物转入BL21感受态细胞，在含有氨苄青霉素抗性的琼脂培养基上进行涂板筛选，挑选合适的单菌落进行菌落PCR检测，阳性样品克隆送至上海生工测序部测序。

1.2.3 重组蛋白的诱导表达 经DNAMAN序列比对后鉴定正确的重组质粒命名为pGEX-4T-Galectin-3。按照1∶100的比例，接种鉴定正确的菌株及pGEX-4T空质粒的菌株到含抗氨苄青霉素抗性的LB培养液中，在37 ℃震荡条件下培养至菌液（600 nm）值在0.4~0.6[8]范围内，而后加入1 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷IPTG进行融合蛋白的诱导表达。5 h后收集菌液，提取蛋白后进行聚丙烯酰氨SDS-PAGE凝胶电泳分析。

1.2.4 重组蛋白的表达条件优化

1.2.4.1 IPTG浓度优化：设置IPTG浓度梯度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L，分别于37 ℃培养5 h后，12 000离心获取菌液沉淀，使用高温灭菌的PBS缓冲液洗涤3次，加入50 μL的PBS悬浮液与10 μL蛋白缓冲液染色，吹匀后100 ℃煮沸5 min，离心后取上清进行SDS-PAGE电泳分析。

1.2.4.2 温度优化：IPTG浓度为1 mmol/L，分别在20 ℃和37 ℃恒温条件下诱导4 h，收集菌液后按照上述步骤进行诱导蛋白处理，进行SDS-PAGE电泳分析。

1.2.4.3 时间优化：在最适的IPTG浓度和温度下分别在震荡培养1、2、3、4、5、6 h时收集菌液，而后进行SDS-PAGE电泳分析。

1.2.4.4 重组蛋白表达形式分析：将在最佳表达条件下诱导表达后的菌体，进行冰上超声波破碎，离心后分别取上清液和沉淀进行SDS-PAGE电泳分析，使用未破碎的全菌做对照，确定重组蛋白的表达形式。

1.2.5 Western blot 分析 纯化后的Galectin-3蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳后，400 mA条件下转印45 min。将蛋白经电转移到PVDF膜上，4 ℃条件下使用含质量分数5%脱脂奶粉的TBST（TBS-Tween-20）封闭2 h，封闭完成后使用TBST缓冲液洗涤3次，每次10 min；以鼠抗GST标签抗体做为一抗对目的蛋白进行在室温条件下孵育2 h，同样TBST缓冲液洗涤3次；以HRP标记的山羊抗鼠IgG作为二抗，与目的蛋白在室温条件下结合1 h，TBST洗涤3次，使用DAB显色试剂盒（碧云天生物技术）显色。

2 结果分析

2.1 Galtin-3基因片段的扩增以及原核表达载体的构建

以罗非鱼脾脏组织的cDNA为模板，用带酶切位点的引物扩增，结果如图1 A所示，片段长度约为690 bp，与预期结果一致。使用pMD-18-T载体上的通用引物M13-47（-）和M13-RV进行PCR扩增，产物片段大小约为850 bp（图1 B），与预期结果一致，表明挑选的菌落为阳性克隆。经NCBI上的序列比对软件Blastx比对显示，测序结果与目的序列100%相符，说明Galactic-3基因载体构建成功。

2.2 大肠杆菌的诱导表达

重组蛋白pGEX-4T-Galectin-3及其空载pGEX-4T菌株经IPTG诱导后的蛋白分子质量约为51 ku和26 ku，与预测的结果一致，说明Galectin-3基因片段已连入pEGX-4T载体并表达Galectin-3融合蛋白。

M：DL2000 DNA凝胶电泳参照物；1：Galectin-3引物GF和GR扩增DNA；2、3：引物M13-47(-)和M13-RV扩增产物

M: DL2000 DNA Molecular Weight Standard; 1: DNA products by Galectin-3 specific primer GF and GR; 2, 3: Primers M13-47(-) and M13-RV amplification products

图1 Galectin-3的克隆（A）及鉴定（B）

Fig. 1 Cloning (A) and identification (B) of galectin-3

M: TRANS蛋白SDS-PAGE电泳参照物；1、2：pGEX-4T诱导前后的全菌蛋白；3、4：pGEX-4T-Galectin-3诱导前后的细菌裂解物

M: TRANS protein SDS-PAGE electrophoresis reference; 1: Empty vector without IPTG inducing; 2: Empty vector with IPTG inducing; 3: Recombinant bacteria without IPTG inducing; 4: Recombinant bacteria with IPTG inducing

图2 融合蛋白pGEX-4T-Galectin-3的原核表达

Fig. 2 Prokaryotic expression of recombinant protein pGEX-4T-Galectin-3

2.3 大肠杆菌诱导表达的条件优化

经系列的SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳结果显示，当IPTG为0.4 mmol/L浓度时，重组蛋白表达量达到最大（图3）。诱导温度为37 ℃时，诱导效果最佳（图4）。诱导时间为5 h的时候，重组蛋白表达量已经达到最大值（图5）。

M：TRANS蛋白SDS-PAGE电泳参照物；1：未经IPTG诱导的Galectin-3细菌裂解液；2-6：IPTG诱导浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的细菌裂解液

M: TRANS protein SDS-PAGE electrophoresis reference; 1: Galectin 3 bacterial lysate not induced by IPTG; 2-6: IPTG induced bacterial lysates at concentrations of 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mmol/L

图3 不同IPTG诱导浓度对pGEX-4T-Galectin-3表达影响

Fig. 3 Effect of different IPTG concentrations on the expression of pGEX-4T-Galectin-3

M1：TRANS蛋白SDS-PAGE电泳参照物； 1、2：37 ℃条件下诱导前后的Galectin-3全菌蛋白；3、4: 20 ℃条件下诱导前后的Galectin-3全菌蛋白

M1: TRANS protein SDS-PAGE electrophoresis reference; 1, 2: Galectin-3 whole bacterial protein before and after induction at 37 ℃; 3, 4: Galectin-3 whole bacterial protein before and after induction at 20 ℃

图4 不同诱导温度对Galectin-3表达的影响

Fig. 4 Expression of protein pGEX-4T-Galectin-3 at different temperature

2.4 Galactic-3重组蛋白可溶性分析

在最佳的诱导条件（诱导剂IPTG浓度0.4 mmol/L在37 ℃下诱导5 h）将pGEX-4T-Galectin-3重组质粒扩大培养至50 mL，在超声波破碎处理后，取含有重组蛋白的细菌裂解液的上清和沉淀进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，结果表明，可溶性蛋白为目的蛋白的主要表达形式，包涵体蛋白表达相对于可溶性蛋白少（图6）。

M：TRANS蛋白SDS-PAGE电泳参照物；1：诱导的全菌蛋白；2-7：IPTG诱导时间分别为1、2、3、4、5、6 h后的Galectin-3的重组蛋白裂解液

M: TRANS protein SDS-PAGE electrophoresis reference; 1, whole induced bacterial protein; 2-7: Total protein of recombinant bacteria inducing at 1, 2, 3, 4, 5, 6 h, respectively

图5 不同时间对Galectin-3表达的影响

Fig. 5 Protein expression of pGEX-4T-Galectin-3 in different inducing time

M：TRANS蛋白SDS-PAGE电泳参照物；1、2：在最适条件下诱导产生的Galectin-3重组蛋白的裂解液上清和沉淀；

M: TRANS protein SDS-PAGE electrophoresis reference; 1, 2: The inclusion body protein and soluble protein induced at optimum induction condition

图6 重组蛋白可溶性分析

Fig. 6 Solubility analysis of pGEX-4T-Galactic-3 protein

2.5 重组蛋白的纯化及鉴定

在最优条件下，即pGEX-4T-G、alactic-3重组蛋白在37 ℃条件下以0.4 mmol/L浓度的IPTG诱导5 h进行蛋白表达，经蛋白纯化柱纯化、SDS-PAGE蛋白凝胶电泳结果可见，可溶性蛋白的为主要的目的蛋白形式表达，且纯化后的蛋白条带单一。Western-blot结果显示，重组蛋白与GST-Tag单克隆抗体发生特异性反应，表明表达的重组蛋白为罗非鱼的Galectin-3蛋白（图7），表明罗非鱼Galectin-3片段重组蛋白成功表达。

M：TRANS蛋白SDS-PAGE电泳参照物；1、4：未诱导的Galectin-3细菌裂解液； 2、5：诱导后的可溶性蛋白；3、6：纯化后的pGEX-4T-Galactic-3重组可溶性蛋白

M: TRANS protein SDS-PAGE electrophoresis reference; 1 and 4: Total bacterial protein before induction of pGEX-4T-Galectin-3; 2 and 5: pGEX-4T-Galectin-3 Bacterial lysate supernatant after induction; 3 and 6: Purified pGEX-4T-Galectin-3

图7 Galectin-3 聚丙烯酰氨凝胶电泳(1，2，3)以及 Western blotting 鉴定(4，5，6)

Fig. 7 Identification of Galectin-3 by SDS-PAGE (1, 2, 3) and Western blotting (4, 5, 6)

3 讨论

Galactin属于动物凝集素，广泛存在于哺乳动物、鸟类、两栖动物、鱼类、线虫和真菌等生物体中，且具有高度保守性[12]。在生物学功能方面，半乳糖凝集素具有调理细胞增殖、调理细胞黏附及调理细胞凋亡等功能[13]。研究发现，经无乳链球菌以及嗜水气单胞菌感染后罗非鱼Galectin-3的mRNA在肾脏、脾脏、鳃和皮肤组织中有较高的表达[2]，表明半乳糖凝集素-3可能在尼罗罗非鱼的免疫应答中起十分重要的作用。这可能是由于鱼的皮肤和鳃在悬浮物的过滤中起着关键的作用，同时这也是对抗病原体的第一道屏障，并参与鱼类的先天免疫和适应性免疫[14-15]，脾脏、肾脏也是重要的鱼类免疫器官[16-17]。然而目前对罗非鱼Galectin-3在蛋白水平上的研究尚未见报道，本研究对罗非鱼Galectin-3的功能结构域进行了克隆鉴定，并成功表达于大肠杆菌中从而获得带GST标签的融合蛋白。

本研究使用的表达菌株为大肠杆菌，而大肠杆菌表达体系是最先应用于蛋白表达研究的，目前最成熟的表达体系。大肠杆菌表达系统的快速且高产量的细胞繁殖、能使用IPTG进行简易快速的诱导表达等特点，使其成为最常用的生产重组蛋白的表达体系[18]。本研究选用pGEX-4T-1表达载体，该载体优点是自带GST融合标签，在大肠杆菌中具一定的溶解度，减少包涵体的形成，对后续蛋白检测、分离纯化与鉴定及蛋白功能的研究提供便利[19-20]。重组蛋白可溶性分析结果显示，Galectin-3蛋白主要以可溶性蛋白形式表达。在科研和生产应用中，重组蛋白在大肠杆菌中的表达形式主要有3种：胞外分泌、周质空间表达及胞内表达[21]，胞外分泌和周质空间表达的蛋白为可溶性蛋白，而胞内表达的蛋白是易无活性的包涵体蛋白。包涵体形成有利于防止蛋白酶对重组蛋白的降解，而且适宜表达一些毒蛋白如抗菌肽[22]，但是这些包涵体形式表达的蛋白通常是错误折叠的，不具备生物活性[23]，这不便于蛋白的节后分析及蛋白组学的研究，所以大多数情况下都将不溶性的包涵体蛋白转化为可溶性的蛋白[24]。本研究中在最适条件下获得的Galectin-3蛋白主要为可溶性蛋白，不需经变性、复性等方法使蛋白重新折叠，即可实现Galectin-3蛋白的大量回收，为后续的单克隆抗体制备奠定了基础。

在纯化过程中，目的蛋白的大量表达与诱导时间、IPTG浓度及诱导的温度有关[8]，笔者对诱导时间、诱导温度及IPTG（异丙基硫代半乳糖）浓度等表达条件进行优化，发现本研究中最佳诱导时间为5 h，对比黄瑜对红笛鲷基因融合蛋白[25]、潘滨对烟草曲茎病毒复制相关蛋白基因[26]、王秋霞对猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts881蛋白[27]及史继静对人基因在原核生物[28]等进行原核表达条件优化的最适诱导时间一般在2~6 h之间，本研究结果在适宜范围内，说明结果可信。本研究结果显示5 h和6 h的蛋白表达量无显著差异，说明超过一定时间，诱导时间的增加不能使目的蛋白持续表达；诱导剂IPTG浓度在0.4 mmol/L时蛋白表达量最大，超过此浓度，蛋白表达量不会随IPTG浓度的增加而增大，说明IPTG对细菌生长有一定的抑制作用，与陆海等[10]研究结果一致；诱导温度为37 ℃时，比20 ℃条件下诱导表达的的目的蛋白量高，推测其原因可能是37 ℃时，与蛋白合成相关酶的活性最大，故催化合成的目的蛋白量最大。随后的Western blot分析表明，未纯化的全菌可溶性蛋白和纯化的Galectin-3蛋白，均能较好地与GST单克隆抗体很好的结合，且条带单一，进一步证明了该重组蛋白为Galectin-3。

4 结论

本研究构建了罗非鱼Galectin-3基因的原核表达载体，确定了最优的融合蛋白表达条件为37 ℃下，0.4 mmol/L浓度的IPTG诱导5 h，并纯化得到了Galectin-3蛋白。

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Prokaryotic Expression and Condition Optimization of Galectin-3 Gene in

LUO Guo-ling，NIU Jin-zhong，HUANG Yu，TANG Ju-fen，CAI Shuang-hu，JIAN Ji-chang

（,524088,）

【Objective】The prokaryotic expression and expression conditions of galectin-3 gene were optimized to obtain a large amount of proteins, laying a foundation for further preparation of monoclonal antibodies.【Methods】Based on the published sequence of Galicon () Galectin-3 gene on NCBI, several pairs of primers withRI andl restriction sites were designed to screen for benign amplification primers, and the tilapia cDNA was polymerase-chained. The prokaryotic expression plasmid pGEX-4T-Galectin-3 of tilapia Galectin-3 gene was constructed by reaction (PCR) amplification, restriction enzyme digestion and T4 ligase ligation, and the recombinant plasmid was introduced intoBL21. In the expression of Galectin-3 recombinant protein, we compared the expression effects of different induction temperature, induction time and IPTG concentration, and screened the optimal conditions for Galectin-3 protein expression. 【Results】pGEX-4T-Galectin-3 was successfully constructed and the Galectin-3 recombinant protein was expressed. It was found that the high expression of Galectin-3 recombinant protein was induced by IPTG at a concentration of 0.4 mmol/L for 5 h at 37 ℃. Western blot results showed that the recombinant protein pGEX-4T-Galectin-3 purified by protein purification column could specifically react with GST-Tag monoclonal antibody, indicating that the expressed recombinant protein is Galectin-3 protein of tilapia. 【Conclusion】In this study, the prokaryotic expression vector of the tilapia Galectin-3 gene was successfully constructed, and the optimal expression conditions of the Galectin-3 fusion protein were determined. The highest concentration was obtained by inducing IPTG at a concentration of 0.4 mmol/L for 5 h at 37 ℃.

；Galectin-3；prokaryotic expression；condition optimization

S917.4

A

1673-9159（2019）04-0035-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.04.006

2019-04-28

国家自然科学基金（31572651）

罗国玲（1996－），女，硕士研究生，研究方向为水产经济动物病害防治。E-mail：1433792702@qq.com

简纪常，男，教授，研究方向为水产经济动物病害防治。E-mail：jianjc@gmail.com

罗国玲，牛金中，黄瑜，等. 尼罗罗非鱼Galectin-3基因的原核表达与条件优化[J]. 广东海洋大学学报，2019，39（4）：35-41.

（责任编辑：刘朏）