日本结缕草Zj ERF 1的克隆、转录激活活性、亚细胞定位及表达分析

滕珂，张蕊，檀鹏辉，岳跃森，范希峰，武菊英*

(1.北京草业与环境研究发展中心，北京100097;2.北京林业大学草坪研究所，北京100083)

植物为适应在生长发育过程中遭受到的多种生物胁迫及非生物胁迫，进化出了复杂的分子调控机制[1]。转录因子是一类能够结合启动子作用元件的DNA结合蛋白，通过激活或抑制相关基因的转录来发挥功能[2]。AP2/ERF转录因子家族以APETALA2(AP2)结构域来命名，是植物中最大的一类转录因子家族之一，广泛参与DNA结合。根据所含AP2结构域的数量，AP2/ERF转录因子可以分为AP2、RAV和ERF(ethylene responsive factor，乙烯响应元件结合蛋白)等类型[3]。AP2转录因子含有两个AP2结构域，主要在花的发育和形态建成过程中起作用。RAV转录因子包含一个AP2/ERF结构域和一个B3结构域，参与植物生长发育和非生物胁迫应答[4]。ERF转录因子只含有一个AP2结构域，根据其结合的位点可分为两类:一类通过结合靶基因的GCC-box来对其转录进行调控，参与乙烯(ET)、茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)等激素的信号转导途径;另一类通过结合CCGAC位点参与多种非生物胁迫途径[5-6]。

目前，前人已经在拟南芥(Arabidopsis thaliana)[6]、水稻(Oryza sativa)[7]、柑橘(Citrus reticulata)[8]和菜心(Brassica campestris)[9]等多种植物中克隆并鉴定出了ERF转录因子，并对其功能展开了深入研究。拟南芥AtERF 7结合GCC-box抑制下游基因的转录，减弱了保卫细胞对ABA的敏感性，提高了植物细胞的保水能力[10]。水稻OsERF 922可通过调控ABA合成相关基因的表达来调节内源ABA的含量，从而改变水稻对盐胁迫的适应能力[11]。柑橘Cit ERF 13通过结合Cit PPH启动子的DRE(dehydration-responsive element，干旱响应元件)来调控其表达，促进叶绿素降解[8]。进一步研究揭示了Cit ERF13可通过抑制叶绿素合成、CO2羧化作用等多种途径抑制光合效率[12]。菜心Br ERF72是一种可受MeJA(methyl jasmonate，茉莉酸甲酯)诱导，细胞核定位且具有转录激活活性的转录因子，可通过直接结合Br LOX4、Br AOC3和Br OPR3启动子的GCC或DRE/CRT(C-repeat，C重复元件)来参与JA合成途径，进而调控植物叶片衰老[9]。

结缕草(Zoysia japonica)是一种重要的暖季型草坪草，因其耐践踏、抗旱性强、耐盐等优点而广泛应用于运动场草坪的建植及城市绿化[13-14]。然而，目前结缕草的遗传资源研究仍十分有限，在GenBank中仅有500多条EST(expressed sequence tags，表达序列标签)序列[15]。深入挖掘结缕草优良的基因资源，不仅可以增强对结缕草抗逆分子机理的认识，而且有助于结缕草性状改良育种。虽然已经从一些模式植物中克隆得到ERF基因，但是ERF在结缕草中的功能研究还鲜有报道，其功能并不清楚。本研究利用RACE(rapid amplification of cDNA ends，c DNA末端快速克隆)技术首次从日本结缕草中克隆得到Zj ERF 1基因，同时利用染色体步移方法对其启动子进行了克隆，并对ZjERF 1基因与其启动子进行了生物信息学分析;研究了ZjERF1的转录激活活性和亚细胞定位特征，并分析了激素及盐、干旱胁迫处理后ZjERF 1基因的表达情况，旨在为深入研究Zj ERF 1基因的功能提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用的日本结缕草品种‘Meyer’由江苏省中国科学院植物研究所刘建秀研究员惠赠，种植于温室，农杆菌EHA105、亚细胞定位载体3302Y3、酵母双杂交载体pGBKT7、Y2HGold酵母菌株及本生烟草(Nicotiana benthamiana)均由本实验室保存。RACE试剂盒、反转录试剂盒、BglⅡ快切酶、Bam HⅠ快切酶、p MD-19T、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、Infusion连接酶和酵母缺陷型培养基等购于宝生物公司(Ta KaRa)。RNA提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒购自OMEGA公司。大肠杆菌感受态DH5α购于天根生化科技公司。PCR Mix、SYBR Mix购自康为世纪公司。PEG4000、乙烯(ET)、脱落酸(ABA)和茉莉酸甲脂(MeJA)购于SIGMAALDRICH。

1.2 方法

1.2.1 Zj ERF 1克隆与生物信息学分析 利用试剂盒提取健康生长的日本结缕草叶片RNA。根据前期转录组数据设计5′/3′RACE的引物(表1)，按照RACE试剂盒说明书进行5′/3′RACE。反应结束后经琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR产物纯化后连接克隆载体p MD-19T，检测为阳性的菌液送北京睿博兴科生物技术有限公司测序，利用DNAMAN 8.0拼接测序结果。根据拼接序列设计引物ZjERF1-F/R，以日本结缕草cDNA为模板扩增基因全长，反应程序为95℃10 min;95℃30 s，57℃30 s，72℃45 s，30个循环;72℃5 min，12℃保温。目的片段纯化后连接克隆载体，检测后测序，测序正确的菌液提取质粒用于后续实验。

利用DNAMAN 8.0软件预测基因编码的氨基酸序列。保守结构域分析及同源比对利用NCBI的Blast功能，用CLUSTALW(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)和BoxShade(https://embnet.vital-it.ch/software/BOX_form.html)在线软件作图。蛋白质的亲疏水性、分子量及等电点推导用ProtParam。信号肽预测使用SignalP 4.1。系统进化树利用MEGA 5.0软件构建。亚细胞定位情况预测用Softberry网站。

表1 引物列表Table 1 Primer list of this study

1.2.2 ZjERF 1启动子克隆与作用元件预测分析 CTAB(cetyltrimethyl ammonium bromide，溴化十六烷基三甲铵)法提取健康生长的日本结缕草叶片DNA，根据ZjERF 1基因gDNA序列的5′端设计染色体步移的3条特异性引物SP1、SP2、SP3(表1)，以日本结缕草基因组DNA为模板进行染色体步移，反应结束后将2、3轮产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，条带单一的PCR产物送去测序。根据染色体步移测序结果设计引物ZjERF1-Pro-F/R(表1)扩增启动子序列，反应程序为95℃10 min;95℃30 s，57℃30 s，72℃90 s，30个循环;72℃5 min，12℃保温，PCR产物纯化后连接p MD-19T载体，阳性菌液送测序。通过PLACE网站(https://sogo.dna.affrc.go.jp)预测Zj ERF 1基因启动子可能存在的作用元件。

1.2.3 ZjERF1转录激活活性验证 以测序正确的p MD-ZjERF1质粒为模板，BD-ERF1-F/R为引物(表1)，用PrimeSTAR进行PCR扩增，反应程序为98℃10 s，98℃10 s，68℃30 s，25个循环;72℃3 min，12℃保温。利用Bam HⅠ单酶切p GBKT7载体，PCR仪中反应15 min。将PCR产物及载体单酶切产物进行纯化，之后在In-Fusion连接酶的作用下进行同源重组。连接产物转化DH5α，挑取单克隆送公司测序，测序正确的菌液提质粒，保菌备用。利用Li AC(lithium acetate，醋酸锂)法[16]，将pGBKT7-ZjERF1转化为酵母感受态细胞，涂布于一缺培养基(SD-Trp)，30℃培养2 d左右。挑取单克隆，PCR鉴定为阳性的菌液，以p GBKT7空载体为对照，分别稀释10、100倍上样，利用Cannon EOS 60D拍照。

1.2.4 Zj ERF1亚细胞定位 设计亚细胞定位载体构建引物3302Y3-ERF1-F/R(表1)，以含有目的基因的质粒为模板扩增目的条带，用In-Fusion连接酶将PCR纯化产物连接入BglⅡ单酶切过的3302Y3载体。构建好的亚细胞定位载体35S::Zj ERF1:YFP转化农杆菌EHA105。采用瞬时表达的方法，将成功转化目的质粒的农杆菌注射本生烟草叶片，暗培养48 h[17]。以3302Y3空载体为对照，利用激光共聚焦显微镜(Leica SP-5)观察YFP荧光在细胞中的分布情况。

1.2.5 ZjERF 1的表达分析 剪取正常生长的日本结缕草成熟植株的根、茎、叶做组织差异分析;剪取幼嫩叶片、成熟叶片、衰老叶片，做不同发育时期的表达分析。选取5盆长势一致的日本结缕草分别喷施200μmol·L-1ET、10μmol·L-1ABA、10μmol·L-1MeJA，浇灌300 mmol·L-1NaCl和20%PEG4000。在处理第0、1、3、6、12、24 h分别剪取不同处理的叶片，液氮速冻后-80℃保存。提取上述样品总RNA，经NanoDrop ND-1000检测合格后反转录为cDNA。设计荧光定量引物qERF1-F/R(表1)，以日本结缕草Actin基因(GenBank登录号:GU290546)为内参进行qRT-PCR反应，每个样品设置3个生物学重复，4个技术重复。用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量[18]。

1.3 数据统计与分析

利用Excel 2010计算表达量，SPSS 18.0进行方差分析，SigmaPlot 12.5作图。

2 结果与分析

2.1 Zj ERF 1全长的获得与生物信息学分析

通过RACE方法从日本结缕草中克隆得到目的基因，命名为Zj ERF 1(图1)。该基因开放阅读框为630 bp，编码209个氨基酸(GenBank登录号:MH294481)。保守结构域分析表明，该基因编码的蛋白属于ERF转录因子家族。氨基酸序列同源比对结果显示，ZjERF1与玉米(Zea mays)、高粱(Sorghum bicolor)及水稻同源性均在80%以上(图2A)。一级结构分析表明，该基因编码蛋白分子量为22.48 k D;理论等电点为5.0，其中阴性氨基酸(Asp+Glu)29个，阳性氨基酸(Arg+Lys)21个;亲水性平均系数为-0.285，属于亲水性蛋白。信号肽预测结果表明，ZjERF1不含信号肽;构建系统进化树发现，ZjERF1与粳稻(Oryza sativa)AP2/ERF-like(BAD 19440.1)亲缘关系最近(图2B)。亚细胞定位预测结果显示，ZjERF1定位于细胞核。

2.2 Zj ERF 1启动子的克隆与作用原件分析

染色体步移结束后，将2、3轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(图3A)，条带清晰的PCR产物送公司测序，测序结果经比对分析，最终获得Zj ERF 1基因ATG上游1581 bp序列。根据得到的序列设计引物扩增Zj ERF 1启动子，得到目的条带与预期相符，经测序分析确定为Zj ERF 1启动子序列。PLACE启动子在线预测分析发现，Zj ERF 1启动子序列中除了有CAAT-box、TATA-box等基本顺式作用元件，还含有与光、植物激素等相关的顺式调控元件。该序列上有1个脱落酸响应元件(ABRE:ABA-responsive element，茉莉酸响应元件)，8个茉莉酸甲酯响应元件(4个CGTCA-motif，4个TGACG-motif)和1个水杨酸响应元件。此外，还有HSE(heat shock element，热休克元件)、MBS(MYB binding site，MYB转录因子结合位点 )、LTR(low-temperature responsiveness，低温响应元件)和TC-rich repeat等若干与非生物胁迫关的应答元件(图3B)。

图1 Zj ERF 1基因的克隆Fig.1 Cloning of Zj ERF 1 gene

图2 Zj ERF 1同源性比对及遗传进化分析Fig.2 Sequences alignment and phylogenetic analysis of Zj ERF1

图3 启动子克隆的染色体步移及其作用元件分析Fig.3 Genome walking for isolating promoter and cis-elements analysis

2.3 ZjERF1转录激活活性分析

尽管大量研究发现AP2/ERF家族的转录因子具有转录激活或转录抑制的作用，而ZjERF1的转录活性特征并不清楚。为分析ZjERF1是否具有激活活性，将构建成功的p GBKT7-ZjERF1载体转化Y2 HGold酵母感受态细胞，以p GBKT7空载体为对照。结果显示，在SD-Trp培养基上对照和p GBKT7-Zj ERF1均可正常生长。之后，将成功转化目的质粒的菌液分别稀释1、10和100倍后点样在SD-Trp-His-Ade培养基上观察其生长情况。结果表明，对照不能在SD-Trp-His-Ade培养基上生长，而p GBKT7-ZjERF1可正常生长。本试验表明:ZjERF1具有较强的自激活活性(图4)。

图4 Zj ERF1转录激活验证Fig.4 Auto-transcriptional activation assay

2.4 ZjERF1亚细胞定位

亚细胞定位预测结果显示，Zj ERF1定位于细胞核，为了进一步研究ZjERF1的定位情况，构建35S::ZjERF1:YFP载体，以空载35S::YFP为对照，质粒成功转化农杆菌后注射本生烟草叶片，48 h暗培养后在Leica SP-5激光共聚焦显微镜下观察黄色荧光蛋白分布(yellow fluorescence protein，YFP)，结果发现，转35S::YFP的荧光信号分布于整个细胞中，而ZjERF1定位于细胞核(图5)。

图5 ZjERF1的亚细胞定位Fig.5 Subcellular localization of ZjERF1

2.5 Zj ERF 1表达模式分析

荧光定量结果显示，Zj ERF 1在根、茎、叶中均有表达，但在茎中的表达量显著高于根和叶片，分别是根中的2.37倍，叶片中的1.77倍(图6A);Zj ERF 1在不同发育时期的叶片中表达量也明显不同，与衰老程度呈正相关性，其在衰老叶片中的表达量最高，幼嫩叶片中的表达量最低。其中衰老叶片的表达量分别是成熟叶片的1.41倍，幼嫩叶片的2.59倍(图6B)。

ET、ABA及MeJA激素处理后的荧光定量结果表明:ZjERF 1的表达可以受到ET的诱导，在处理的第6 h达到最高水平，为初始水平的5.12倍(图6C);Zj ERF 1的表达在喷施ABA后的前3 h呈下降趋势，但在处理的第6 h表达量显著升高，为第3 h的20.0倍，之后又表现出显著下降的趋势(图6D);Zj ERF 1的表达总体上受到MeJA的诱导，在处理6 h达到峰值，为初始水平的2.31倍(图6E)。

高盐和干旱胁迫处理后的荧光定量数据显示:在处理的24 h内，300 mmol·L-1的NaCl处理诱导了Zj ERF 1的表达，具体表现为在第3 h开始升高，为第1 h的1.39倍，而在第12 h达到峰值，为处理前的3.99倍(图6F)。而20%的PEG4000处理显著抑制Zj ERF 1的表达，表达量随着处理时间的延长逐渐下降，在6 h达到最低值，为初始水平的1.47×10-3倍(图6G)。

3 讨论

目前关于ERF基因的研究主要集中在拟南芥和水稻等模式植物中，在结缕草上的研究却鲜有报道。本研究利用RACE的方法从日本结缕草中克隆得到ZjERF 1基因，蛋白保守结构域分析表明，ZjERF 1属于ERF转录因子家族。Zj ERF 1拥有1个高度保守的含有65个氨基酸残基的AP2 DNA结构域，具有高度结合GCC-box的潜力，能够调控相关基因的表达[6]。构建系统进化树发现ZjERF1与粳稻AP2/ERF-like(BAD19440.1)的亲缘关系最近。拟南芥中的研究发现，EAR motif对于ERF转录因子发挥转录抑制的作用至关重要[19]。本研究转录激活活性分析表明，ZjERF1具有较强的转录激活活性，可以发挥转录调控的功能，分析这可能与其不含EAR-motif有关。亚细胞定位结果显示，ZjERF1定位于细胞核，这与柑橘CitERF13[20]、小麦(Triticum aestivum)TaERF W17[21]、菜心Br ERF72[9]的定位结果一致。以上结果表明:ZjERF1属于典型的ERF转录因子，具有转录激活活性，定位于细胞核，可调控下游相关基因的表达，能够参与多种转录调控过程。

图6 Zj ERF 1表达特征分析Fig.6 Real-time quantitative PCR of Zj ERF1 expression characters

启动子作为基因的组成部分，控制转录起始的过程，它在一定程度上决定了基因表达的时间、部位及强度，启动子的研究是基因表达调控研究的基础[22]。作用元件是RNA聚合酶直接结合的区域，对启动子的活性影响显著[23]。前人研究表明，不同植物中的ERF转录因子可同时响应茉莉酸、脱落酸、非生物胁迫等因素的调节[9，24]。本研究通过染色体步移的方法获得了Zj ERF 1基因ATG上游1581 bp序列，分析发现，该序列上除了含有TA-TA-box、CAAT-box等基本作用元件以外，还存在着多个响应MeJA、ABA和非生物胁迫诱导(干旱、热、冷)的作用元件。据此推断Zj ERF 1是一个非常重要的转录因子，可同时参与激素信号传导和响应非生物胁迫过程，并在其中行使着不同的功能，值得深入开展研究。此外，启动子作用元件分析预测Zj ERF 1可受MeJA等激素和非生物胁迫的调节，为进一步研究ZjERF 1的表达特征提供了依据。

不同组织荧光定量结果显示，Zj ERF 1在根、茎、叶中均有表达，其中茎中的表达量显著高于其在根和叶片中的表达量，这与拟南芥AtRAP 2.6的表达特征一致[24]。不同发育时期的叶片荧光定量结果表明，Zj ERF 1在衰老叶片中的表达量最高，这与菜心BrERF 72的研究结果一致[9]。植物叶片的衰老与乙烯的合成密切相关，而ERF作为乙烯途径中的一个关键转录因子，在叶片衰老过程中发挥着重要功能[25-26]。本研究发现喷施ET可诱导Zj ERF 1的表达，这与ORA 59的表达情况一致[27]。这表明Zj ERF 1可响应乙烯信号，推测可以在乙烯调控的一系列信号转导过程中发挥转录调控功能。研究表明ABA是一种促衰老激素，外源ABA可以诱导衰老相关的基因的表达[28]。本研究发现ABA可调控Zj ERF 1基因的表达，这与拟南芥AtRAP 2.6[24]和柽柳(Tamarix hispida)Th ERF 7[29]的表达情况一致，说明Zj ERF 1可参与ABA调节的叶片衰老过程。菜心中的研究结果表明，BrERF 72可受JA的诱导，并通过直接结合JA合成基因的启动子来调节JA的合成，证明了ERF可参与JA调节的叶片衰老[9]。本研究中发现Zj ERF 1启动子含有多个响应MeJA的作用元件，并且MeJA处理显著诱导ZjERF 1的表达，因此Zj ERF 1可能参与了调控植物衰老的进程，需要进一步的研究挖掘下游靶基因。此外，我们还发现Zj ERF 1的表达在NaCl处理的第12 h急剧升高，这与Th ERF 7的表达情况类似;而Zj ERF 1的表达在PEG处理的24 h内始终表现出受抑制的趋势，与Th ERF 6的情况一致[29]。以上分析说明Zj ERF 1的表达可受多种条件的调控，推测其在激素信号传导和非生物胁迫中发挥着不同的作用。

4 结论

日本结缕草Zj ERF 1基因开放阅读框为630 bp，编码209个氨基酸。保守结构域分析表明，Zj ERF 1属于ERF转录因子家族。同时，通过染色体步移的方法得到Zj ERF 1基因ATG上游1581 bp的启动子序列，该序列含有多个响应MeJA及非生物胁迫的作用元件。转录激活分析表明，Zj ERF1具有较强的转录激活活性。亚细胞定位结果显示，ZjERF1定位于细胞核。荧光定量数据表明，Zj ERF 1在衰老叶片中的表达量最高，且Zj ERF 1的表达受ET、MeJA及盐和干旱处理的调节。本研究表明Zj ERF 1可响应多种因素的调节，并在激素信号传导和非生物胁迫中发挥着不同的作用，为进一步探索Zj ERF 1基因的功能及其转录调控机制奠定了基础。