螺内酯对代谢综合征大鼠心肌重构的干预作用＊

张小云，张旭升，黄战军，樊小容，谭小青，蔡博治

代谢综合征（metablicsyndrome，MS）包括糖耐量减低、中心性肥胖、脂代谢紊乱、高尿酸血症、高血压及心脑血管疾病。大量研究证实，MS可引起血管内皮功能障碍、动脉粥样硬化及心肌纤维化等疾病的发生发展，最终导致心血管重构［1，2］。MS 诱导的心肌重构过程非常复杂，研究发现其与高血脂、胰岛素抵抗及高血压等相关，分子机制包括炎症反应、血管活性肽及脂肪细胞因子等作用相关。而醛固酮［2］（ALD）是体内具有促体内多种器官组织纤维化的活性因子，尤其与心血管重构的关系密切，主要与盐皮质激素受体结合发挥各种生物学效应，但是否参与MS诱导的心肌重构目前尚不清楚。为此，该研究通过建立MS模型鼠诱导心肌重构，并观察该过程中ALD及其受体的表达和变化；采用醛固酮受体阻滞剂螺内酯干预，观察其对心肌重构的影响。

1 材料与方法

1.1 实验药品、仪器及动物雄性SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。高果糖饲料购自北京华阜康生物科技有限公司；醛固酮放射免疫试剂盒购自北京华英生物研究所；盐皮质激素受体一抗购自北京博奥森生物技术有限公司，二抗及DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；其余为进口或国产分析纯试剂。血糖试纸及快速血糖仪购自美国雅培；鼠尾动脉无创测压仪由汕头大学医学院动物实验中心提供；Beckman Coulter AU5800由汕头大学医学院第一附属医院检验科提供。

1.2 MS动物模型制备取雄性SD大鼠8只作为正常对照组，普通饲料喂养；取雄性SD大鼠16只作为MS组，用高果糖饲料喂养10周，检测尾动脉压、血糖和血脂水平，以确定MS模型建立成功。将造模成功的MS大鼠随机分成MS组（8只）和MS+螺内酯组（8只），均继续高果糖喂养，MS+螺内酯组每天予螺内酯40 mg/kg·d灌胃1次。4周后称重，3%水合氯醛麻醉，从心脏取血，将部分血液置入含有EDTA的试管中，4℃离心分离血浆，-80℃冰箱保存。迅速分离出心肌标本，切取部分心肌组织，用冰生理盐水洗净残余血液，4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋用于染色，其余锡纸包裹，-80℃冰箱保存。

1.3 血压、血糖和三酰甘油的测定采用鼠尾动脉测压仪测量血压；禁食8 h后尾动脉取血，快速血糖仪检测血糖，并迅速用离心机分离出血清，使用Beckman Coulter AU5800生化仪检测血清三酰甘油水平。

1.4 心肌组织胶原Masson染色取大鼠心肌组织，用4%多聚甲醛固定，脱水，石蜡包埋，制作4 μm厚连续切片，常规脱蜡、水化、脱水，进行Masson染色。在光镜下观察、照相，进行图像学分析。

1.5 血浆和心肌ALD含量的测定将血浆和心肌组织标本用干冰保存，送北京华英生物研究所，采用放射免疫法测定血浆和心肌组织中ALD含量，具体步骤按试剂盒说明书操作。

1.6 免疫组织化学检测心肌组织盐皮质激素受体的表达取心肌组织制备组织切片，石蜡包块，制作4 μm厚连续切片，常规脱蜡入水，抗原修复，封闭非特异性抗原，滴加盐皮质激素受体一抗过夜，滴加二抗，DAB显色，苏木素复染，盐酸酒精分化、脱水、透明、中性树胶封片，具体步骤按说明书进行。

1.7 统计学方法采用Graph pad prism4统计软件进行数据处理及统计学分析。计量资料用（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析法，两两比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠MS模型特征使用高果糖饲料喂养大鼠10周后，其平均动脉压、血糖、三酰甘油水平明显高于正常对照组，提示建模成功，见表1。

表1 两组间平均动脉压、血糖、血脂比较（±s）

表1 两组间平均动脉压、血糖、血脂比较（±s）

注：与正常对照组比较，＊P＜0.01。

三酰甘油（mmol/L）正常对照组 8 102.65±7.25 0.85±0.55 2.22±0.55 MS 组 16 128.85±6.85＊ 2.68±0.61＊ 6.78±0.67＊组别 n 平均动脉压（mmHg）血糖（mmol/L）

2.2 大鼠心肌组织Masson染色采用Masson染色观察大鼠心肌组织，与正常对照组比较，发现MS大鼠心肌组织有明显胶原沉积，心肌细胞排列紊乱。用螺内酯干预后，心肌胶原沉积有所改善。见图1。

图1见封三。

2.3 大鼠血浆和心肌组织ALD含量的变化MS组心肌组织ALD表达明显增加，采用螺内酯干预后，ALD表达明显下调；3组血浆醛固酮水平无统计学差异。见表2。

表2 血浆和心肌组织醛固酮含量比较（±s）

表2 血浆和心肌组织醛固酮含量比较（±s）

注：与正常对照组比较，＊P＜0.01；与 MS 组比较，#P＜0.01。

组别 n 心肌组织ALD（ng/g蛋白）血浆ALD（ng/L）正常对照组 8 8.25±1.55 86.45±5.55 MS 组 8 27.65±3.55＊ 91.47±5.85 MS+螺内酯组 8 18.55±6.23＊# 90.55±5.25

2.4 大鼠心肌组织盐皮质受体表达的变化与正常组相比，MS组心肌组织盐皮质激素受体表达明显上调，用螺内酯干预后，心肌组织盐皮质激素受体表达有所下调。见图2。

图2见封三。

3 讨论

MS与许多心血管疾病的发生和发展密切相关，是目前心血管领域研究的热点。大量研究发现MS大鼠模型可出现心肌重构，表现在心肌细胞排列紊乱，胶原蛋白沉积明显。其分子机制可能与炎症反应、部分血管活性肽如尾加压素Ⅱ及脂肪细胞因子作用等相关［2-4］。因此，探索参与MS心肌重构的因子，对于揭示心肌重构机制并为其防治提供新的临床策略具有重要意义。

ALD是肾素-血管肾张素-醛固酮系统（RASS）的终末激素，也是体内重要的盐皮质类固醇激素，ALD主要通过经典的血管紧张素转换酶途径和心血管等组织自分泌/旁分泌的方式产生。其中心血管组织的ALD合成不受血浆ALD水平的影响，可以单独作用于血管壁、心肌组织，可引起局部组织炎症反应、纤维化、胶原蛋白及钙盐的沉积等，因此ALD 在心血管重塑过程中起着重要的作用［2，5-7］。 该实验结果表明，采用高果糖饲料喂养大鼠后，其血压、血糖及三酰甘油明显高于正常对照组，成功建立MS大鼠动物模型。采用Masson染色，观察到心肌组织全程均有胶原蛋白明显沉积，心肌细胞排列紊乱，提示心肌重构。与此同时，心肌组织ALD含量与其相应受体表达明显增加，诱导局部组织炎症反应、胶原沉积等生物学效应，进一步加重心肌重构的进展。因此，采用ALD特异受体拮抗剂螺内酯干预，可逆转心肌重构这一病理过程。而三组大鼠血浆ALD水平无明显差异，这提示醛固酮/盐皮质激素受体系统可能参与了MS大鼠心肌重构的过程，并且是通过自分泌/旁分泌的方式起作用的。

实验证实ALD能通过氧化应激等机制，诱导心血管组织周围炎症反应，如细胞黏附分子-1、单核细胞趋化蛋白-1和肿瘤坏死因子α等炎症因子的表达增加，导致血管、心肌局部组织纤维化的发生发展，而选择性ALD受体拮抗剂能降低炎症因子的表达，延缓心肌和血管的损伤。外源性醛固酮还可诱导心肌成纤维细胞增殖，促进胶原蛋白合成［6，7］，而细胞增殖和细胞间质胶原蛋白的沉积是心血管纤维化过程中重要的病理条件。所以，ALD与心血管重构事件的发生密切相关，该课题组亦在动物血管钙化模型中证实ALD可促进大鼠血管钙化及纤维化的进程［8，9］，涉及的分子机制与炎症反应等相关。综上所述，在病理状态下，局部组织ALD水平表达增加（旁分泌、自分泌的方式），通过结合盐皮质激素受体，激活相关分子途径如诱导炎症反应、氧化应激等作用，通过Rho激酶等信号转导通路［10，11］，刺激心肌细胞增殖、胶原沉积等，促进心肌重构的发生和发展。

ALD曾被认为主要起调节体内钠钾离子平衡的作用，随着研究不断深入，它不仅是体内重要的促纤维化物质，还是重要的促炎症因子。该实验发现MS大鼠心肌重构，心肌组织醛固酮/盐皮质激素受体的表达明显增加，提示醛固酮/盐皮质激素受体系统参与了心肌重构的过程，用螺内酯干预可明显逆转该过程，为心肌重构的机制奠定理论基础，并为防治提供新的临床思路，其内在的信号转导通路尚需进一步研究证实。