循环肿瘤DNA研究进展及其临床应用现状＊

高明正，张 瑾，潘 云，李 艳

循环肿瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）可以利用患者的血液及其他体液（如尿液、唾液等）检测癌症的成分及来源。循环肿瘤DNA作为液态活检（liquid biopsy）中的一部分，能够实时反映肿瘤状态，通过对其检测可以快速实现疾病分子的鉴定，有利于疾病的早期诊断、准确预后、疾病监测及个体化治疗。随着科技及医疗的不断进步，肿瘤分子研究的不断深入，ctDNA与肿瘤相关的研究不断被报道，下面就对ctDNA进行详细介绍。

1 ctDNA的生物学特征

ctDNA，指外周血液循环系统中肿瘤基因组的游离DNA，这些游离的片段反映了肿瘤的信息［1］循环游离 DNA（circulating free DNA，cfDNA）即非细胞结合的DNA，存在于血清或血浆细胞外的DNA，是无创唐氏筛查的基础。1948年mandel等［2］首次描述了人血液中循环游离DNA。随后Leon等［3］于1977年发现cfDNA的浓度在癌症患者中明显高于非癌症患者，开辟了后续一系列的研究。ctDNA来源于肿瘤的坏死、肿瘤凋亡、肿瘤细胞直接分泌以及外泌体的释放［4-7］。 cfDNA 含量及完整性［8-10］ctDNA 突变频率［11-13］、微卫星杂合性［14］以及甲基化频率［15-17］这些都可以进行研究。cfDNA片段大小不一，主要受到提取方法、肿瘤释放方式的影响，测序发现cfDNA的大小主要集中在180 bp左右，长度为包裹在核小体蛋白复合物上DNA的长度［18-19］。且对于非突变的cfDNA来说，长度要长于ctDNA［20］。ctDNA的含量通常占总循环游离DNA的0.01%［21，22］这对临床检测来说是一种挑战。cfDNA的半衰期较短，数min到2.5 h不等，可以实时监测体内ctDNA的变化［23-25］。

2 ctDNA检测的相关技术

ctDNA带有与原发肿瘤相关的遗传信息，在研究肿瘤的发生发展、个体化医疗具有重大意义。半衰期比较短，能够精确评估数小时的肿瘤变化，比影像学或蛋白标记早数周甚至数月发现肿瘤的改变；较高的特异性，避免了假阳性的结果；代表肿瘤负荷，能评估肿瘤的动态；浓度水平随着疾病进展而增加，也会因为药物治疗或者手术而降低，可以检测肿瘤对于治疗的反应、评估患者治愈情况及残留病灶情况，从而防止疾病的复发；临床通过对肿瘤相关分子的检测揭示肿瘤发生的机制，从而对作用靶点“对症下药”，精准治疗到每例患者与精准医疗的主题相契合。虽然技术应用场景广阔、优势明显、市场潜力巨大，但是在实际的临床应用和推广方面还面临着一系列的挑战，比如数量少、需要扩增、检测方法灵敏性较低，如何进行高效的捕获与检测成为重要环节。随着科技的发展、医疗水平的提高，相对应地更特异性与灵敏性的捕获检测技术被开发出来。

检测ctDNA的技术主要有：Sanger法、实时荧光定量 PCR（real-time PCR，RT-PCR）、二代测序技术（next generation sequencing，NGS）、突变扩增系统（amplification refractory mutation system，ARMS）、质谱法 （mass spectrometry，MS）、数字 PCR（digital PCR，dPCR）： 包括 BEAMing和微滴式数字 PCR（droplet digital PCR，ddPCR）。 标记扩增深度测序（TAM-Seq）、 癌症个体化深度测序 （CAPP-Seq）等（表1）。利用这些技术对ctDNA进行检测，及时了解患者病情从而达到治疗肿瘤的目的。下面是ctDNA相关检测技术各自特点介绍。

2.1 Sanger法1977年 Sanger等［26］首先用于噬菌体x174的基因测定，在被科学家称作 “登月计划”的人类基因组计划 （human genome project，HGP）中Sanger法发挥了重要作用。该法利用了双脱氧链终止的原理。Beaver等［27］通过对29例早期乳腺癌患者的肿瘤组织和血浆的PIK3CA进行研究，检测到肿瘤组织与血浆中的突变，对患者的复发风险的评估、指导患者的化疗具有重要意义。Sanger法具有检测明确、成本低、准确率高等优点，但通量低也限制其无法满足当前的高通量测序的需要。

2.2 NGS新一代测序技术。通过平行测序、边合成边测序的思想。测序的大致流程包括：DNA文库的构建、文库分子克隆扩增、测序及分析。以高通量、高灵敏度、高精确度等优势在ctDNA中检测多个已知或未知突变而广泛应用，Forshew等［28］通过对卵巢癌患者的TP53、EGFR、KRAS的检测，这种高通量的方法可以作为一种无创的 “液体活检”方式，方便分析ctDNA，用于个体化癌症基因组学的研究。Narayan等［29］对非小细胞肺癌的研究，NGS可以作为一个实际的诊断测试的基础来测量血液中来源于肿瘤的DNA水平。

2.3 ARMS-PCR扩增阻滞突变系统。是在PCR的基础上建立起来的［30］，利用PCR与凝胶电泳可以检测DNA的点突变。引物的3′端碱基与模板的碱基如果不互补，一般的耐热DNA聚合酶则无法进行延伸，ARMS-PCR就是根据已知点突变来设计3条引物，3′端碱基会分别与正常和突变的模板碱基互补配对，从而将有点突变的模板与正常模板区别出来。因其操作简便、用时较短、成本低等优点，广泛应用于各种基因的多态性研究。Board等［31］研究发现PIK3CA的突变在76例乳腺癌的血清与肿瘤组织的一致性为95%，PIK3CA可以作为一种预测性生物标志物。

2.4 数字PCR该技术的出现在ctDNA的研究中发挥了重要作用，相较于普通的PCR，数字PCR能够直接计数DNA的个数，实现对样本的绝对定量。尤其适用于Ct值不能很好发挥的领域。微滴式数字PCR，利用阴性体系与阳性体系的数量，泊松分布的原理，计算出目的片段的绝对拷贝数［32］。在进行传统的PCR扩增前需对样本进行相应的微滴化处理，通过油包水结构，生产20 000个均一的微滴，每个微滴都是独立的体系。PCR扩增后对每个微滴进行检测，有荧光的标记为1，反之则为0，可以得到 靶 分 子 的 浓 度 和 拷 贝 数 。 Hindson等［33］在analytical chemistry杂志上发表了微滴式数字PCR在DNA拷贝绝对定量的应用，具有里程碑的意义，使得该技术在ctDNA的研究中更加规范化。Bettegowda等［16］评估 640例不同类型癌症患者，发现不同疾病的检测率不同，卵巢癌、胰腺癌、结肠癌等检测率比肾癌、脑癌、甲状腺癌、前列腺癌要高一些，在对其中206例转移性结直肠癌患者研究中，检测ctDNA中的KRAS突变敏感性（87.2%）、特异性（99.2%），这些都表明ctDNA是一种广泛适用、特异性和敏感性的生物标志物。

表1 ctDNA相关检测技术介绍

2.5 BEAMing数字PCR与流式技术的结合，特异性PCR引物扩增完目标突变区域后，与磁珠（带有特异PCR引物）混合后进行油包水结构的扩增反应，利用带颜色的荧光探针结合磁珠上的特异PCR产物，再用流式细胞仪分析磁珠的颜色从而确定突变的情况。Diehl等［24］对18例结肠癌患者中192份血浆样本ctDNA突变情况进行分析，检测灵敏度可达0.005%。

2.6 其他检测技术在ctDNA的研究中，实时荧光定量 PCR也被应用［34］。此外质谱法，通过离子飞行时间的判读，测出其分子质量。用于ctDNA的最大优势是准确性高、稳定性强、重复性好、速度快、样本标准化处理。对基因突变、基因分型、DNA甲基化、基因表达、单倍体序列差异、拷贝数变异等多项检测与分析［35］。 TAM-Seq，用特异性引物进行循环目标区域的预扩增，再利用不同特性的接头标签继续第二次扩增。双向重复测序提高了测序的精度，高突变频率、高敏感性、高特异性、低成本都有利于临床应用［36］。 CAPP-Seq，用定制化的突变位点库做“筛选器”，相应的样本进行靶向捕获然后进行深度测序，用于ctDNA的研究灵敏度及特异性更强，价位合适［28］。

3 ctDNA的临床应用

现在肿瘤诊断面临的问题是早期诊断比较困难，患者往往错过最佳治疗时机；放化疗产生药物耐药性，缺乏有效的治疗靶点；易复发转移，预后较差等。因此早发现、早诊断、早治疗，实时检测、靶向用药、个体化诊疗是提高肿瘤远期生存率降低病死率的关键。目前，ctDNA作为一种广泛应用前景的肿瘤标志，可以用于肿瘤患者早期诊断，肿瘤发展过程检测、判断预后、个性化指导用药。现今关于ctDNA的应用研究日益增多。

3.1 早期诊断及肿瘤发展过程检测对于肿瘤患者来说，传统的影像学、病理检测等往往都是疾病发展的晚期，不能够早期及时诊断，是延误肿瘤治愈的主要原因。cfDNA是肿瘤负荷的反应，肿瘤患者血浆中的含量要明显高于非肿瘤患者，对其进行定量检测并且与ctDNA体细胞突变结合，能够更好地提供有效信息。对孕妇血液检验，进行无创唐氏筛查，确定患儿疾病的风险，这是液态活检临床最常用的方法。在一项对不同单基因风险的孕妇血液样本的检测中，正确区分受累和未受累的妊娠，并且在第一周就检测出第一个受累的妊娠。胎儿分数低至3.7%［37］。这对疾病的早期诊断、疾病管理、减少并发症具有重要意义。胰管腺癌（PDAC）是最常见的恶性肿瘤，发现后往往预后很差，对52例胰管腺癌术前血浆凝固酶敏感蛋白-2（THBS2）、CA19-9进行测定，ctDNA进行定量分析。Logistic分析发现将CA19-9、THBS2及cfDNA三者结合统计值增加到了0.94。这种组合为早期胰管腺癌的早期无创诊断奠定了基础［38］。 Zhang 等［39］对卵巢癌、卵巢囊肿及健康患者的血液样本进行对照，发现ALU-219浓度和ALU-219/ALU-115比值可以作为卵巢癌的诊断标志物，血浆ALU水平的检测可以单独或者联合应用于卵巢癌的早期诊断，此外还可采用可重复的方法实时监测肿瘤在疾病进展过程中的演变。

3.2 判断预后在一项对155例肝癌患者手术切除的研究，胰岛素样生长结合蛋白-7（IGFBP7）甲基化组要明显高于非甲基化组，Kalian-Meier曲线表明，IGFBP7甲基化与总生存率显著相关（P＜0.001），且IGFBP-7甲基化是肝癌肝切除术后和早期肿瘤复发的独立预测因子（P=0.008）［40］。 Soliman 等［41］在非小细胞肺癌 （NSCLC）、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、健康患者血浆中 ALU-215、ALU-247及cfDNA含量进行研究，发现非小细胞肺癌的含量明显高于后两者，血清中cfDNA在NSCLC无创血液筛查中有很好的应用前景，且cfDNA升高与患者的预后相关。Lee等［42］利用 5736例乳腺癌血液中ctDNA 进行液态活检，TP53、ESR1、PIK3CA 的突变频率分别为38%、32%、27%。ctDNA突变可以预测疾病复发和不良的预后。Bernard等［43］对34例患者123份血液样本进行外显子和ctDNA的纵向分析，包括COX回归、Fisher检验、Bayesian推断，将外显子和ctDNA的KRAS突变与预后联系在一起，显示外显子和ctDNA水平的升高与疾病的进展显著相关（P＜0.003），外显子和ctDNA的使用提供了与治疗相关的预测和预后信息。

3.3 个性化指导用药通过对酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗的EGFR突变的非小细胞肺癌的研究，治疗后患者EGFR突变状态显著改变，治疗后突变状态的改变可以指导临床医师进行个性化用药［44］。最近在术后监测下对结直肠癌患者的研究表明ctDNA复发的证据可能发生在临床检测前几个月，ctDNA的另一个可能作用是进一步评估CEA或CT不能够确定的结果，能够更早地诊断出来从而有利于对患者及时用药。对45例结直肠癌血液样本的评估中，有14例（31%）检测到了ctDNA，在两年的随访中，21例患者 （47%）出现复发，检测到的ctDNA与较低的无复发生存率相关 （HR 4.85，P＜0.01），对于不确定的结肠癌患者，ctDNA的分析是有必要的，早期发现有利于早期个体化治疗［45］。一项对于转移性前列腺癌的液态活检中，53例患者在治疗过程中检测ctDNA，经短期（中位数22d）雄激素剥夺治疗（ADT）后，患者的ctDNA和DNA的中位数分别为 11%（0～84%）和 1.0%（0～51%），在 47%和21%的队列中，TP53突变和DNA修复效果分别被识别，配对样本一致检测率为80%［46］。ctDNA能够提供患者的突变信息，将其与原发组织结合是评估分子亚型的最佳方法，有助于个体化精准医疗下对患者的靶向治疗。

总之，伴随着肿瘤发生发展机制的不断阐明，影响肿瘤调控的内外环境因素及耐药机制等不断研究，ctDNA在肿瘤检测领域的运用受到越来越多的重视。ctDNA以方便、实时、侵害性小和鉴别诊断能力强等优势，可以对肿瘤的演化和适应性改变以及药物治疗效果进行实时监控，从而更能有效指导临床对肿瘤早期诊断、检测发展过程、判断预后及个体化用药。但是ctDNA数量少、需要扩增、对检测方法的灵敏性要求高，相信在不久的将来随着精准医疗的不断发展，液态活检在各种疾病中的不断应用，ctDNA将以其独特的方式，在未来肿瘤的检测实践中崭露头角。