乳酸菌发酵饲料对SPF 鸡免疫功能的影响

李 锦，朱风华，陈 甫，朱连勤

（青岛农业大学动物医学院，山东青岛 266109）

乳酸菌是应用最早、最广泛的益生菌，是一类可利用碳水化合物发酵产生大量乳酸的细菌总称。乳酸菌具有益生菌的效用，如维持动物胃肠道菌群平衡、提高机体免疫水平、促进动物生长和改善肠道环境，具有良好应用价值。Missotten 等[1]用植物乳杆菌饲喂1 日龄肉鸡，饲料利用率明显提高。付丽[2]将添加乳酸菌的饲料饲喂艾拔益加（AA）肉仔鸡，肉鸡免疫器官指数、血清鸡新城疫抗体（NDV-Ab）效价、血清IgA 含量均有显著提高。张晓羊等[3]报道，与饲喂6%棉粕的基础饲料相比，饲喂含6%嗜酸乳杆菌发酵棉粕的试验饲料蛋鸡组的脾脏指数、法氏囊指数和血白细胞介素-2（IL-2）含量均显著提高，脾脏中白细胞介素-10（IL-10）mRNA表达量极显著提高。孙伟[4]研究发现，用乳酸菌发酵饲料置换蛋鸡配合饲料可提高血清禽流感病毒H9 亚型（AIV H9N1）和NDV-Ab 水平。大部分研究表明乳酸菌可以增强家禽免疫功能，但乳酸菌发酵饲料是否是通过作用SPF 雏鸡信号通路来提高雏鸡免疫功能，尚少见报道。因此，本研究以SPF 雏鸡为试验对象，通过研究乳酸菌发酵饲料和PI3K 阻断剂对其体液免疫、细胞免疫功能以及脾脏组织中PI3K、Akt mRNA 基因表达量和PI3K、Akt 蛋白表达量的影响，探讨乳酸菌发酵饲料提高SPF 鸡免疫功能与SPF 鸡PI3K/Akt 信号通路的关系。

1 材料与方法

1.1 试验设计 选取14 日龄SPF 雏鸡120 羽，随机分为4 组，每组5 个重复，每个重复6 羽。对照组饲喂基础饲料，发酵饲料组饲喂乳酸菌发酵饲料，基础阻断剂组为基础饲料+PI3K 阻断剂，乳酸菌阻断剂组为发酵饲料+PI3K 阻断剂。基础阻断剂组、乳酸菌阻断剂组受试鸡每天每羽灌服1 mL 阻断剂LY294002（含阻断剂0.7 mg），连续灌服21 d。对照组、发酵饲料组于相同时间灌服相同剂量的生理盐水。试验期21 d。雏鸡自由饮食，按正常免疫程序进行免疫接种。

1.2 基础饲料与发酵饲料 乳酸菌发酵饲料制作参照王赫等[5]方法。基础饲料和发酵饲料组成及营养成分见表1。

表1 基础饲料和发酵饲料组成及营养成分（风干基础）

1.3 试验材料 LY294002（HY-10108）购自Med Chem Express（Monmouth Junction，NJ，USA)；植物乳杆菌（20765）、嗜酸乳杆菌（6006）均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；Akt 抗体（ab106693）购自Abcam中国；PI3K 抗体（bs-2067R）购自北京博奥森生物技术有限公司；磷酸化Akt（Phospho-Akt）（Ser473）抗体（AA329）、辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔IgG（A0216）、HRP 标记山羊抗小鼠IgG（A0208）均购自碧云天生物技术；MMT 试剂盒购自美国 Sigma 公司；NDV-Ab、IgA、IgM、IgG、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6 ELISA 试剂盒购自上海润裕生物科技有限公司。

1.4 主要仪器设备 电泳仪（美国Bio-Rad 公司）；MK3 型酶联免疫酶标仪（赛默飞世尔仪器有限公司）；低温超速离心机（上海安亭科学仪器厂）；Gel Doc 1000 凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad 公司）；PCR扩增仪（美国ABI 公司）；Step One plus 型荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）；紫外可见分光光度计（日本Bio Spes-nano 公司）；Tanon 4200 全自动化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司）。

1.5 检测指标与方法

1.5.1 生长性能 于试验第1 天和21 天称体重、称饲料，以重复为单位计算雏鸡试验期间的平均日增重（ADG）、耗料增重比（F/G）和平均日采食量（ADFI）。

1.5.2 外周血淋巴细胞转化率 于试验第21 天从各组每个重复中各随机取1 羽鸡，进行无菌翅静脉采集抗凝血，刀豆蛋白A（ConA）、脂多糖（LPS）刺激淋巴细胞增殖，方法及条件优化参照冯焱等[6]，于570 nm处测定OD 值，测得T、B 淋巴细胞转化率。

1.5.3 抗体与细胞因子 于试验第21 天各组每个重复中各随机取1 羽鸡，心脏无菌采集血液，4℃静置1 h，3 000 r/min 离心15 min，分离血清，-20℃保存。用酶联免疫吸附法测定雏鸡血清中NDV-Ab、IgA、IgM、IgG、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6 含量。

1.5.4 PI3K、Akt mRNA 表达量的测定 取15～20 mg脾脏，用碧云天生物技术RNAeasyTM动物RNA 抽提试剂盒（离心柱式）提取组织总RNA。紫外可见分光光度计测定总RNA 浓度及纯度，所有样品OD 比值（OD260nm/OD280nm)在1.8～2.0，1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA 完整性，-80℃保存。

使用碧云天生物技术BeyoRTTMⅡcDNA 合成试剂盒（with gDNA Eraser）逆转录试剂盒将总RNA 逆转录为cDNA，所得cDNA 于-20℃保存或直接用于实时荧光定量PCR 检测。

实时荧光定量PCR 检测目的基因表达情况，使用碧云天生物技术BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix（2X）试剂盒检测PI3K、Akt mRNA 的表达量，并用实时荧光定量PCR 仪测定。根据GenBank 上公布的鸡PI3K、Akt 基因的保守核苷酸序列，用Primer 设计并合成3 对特异性引物（表2），以cDNA 为模板进行PCR 反应，以β-肌动蛋白（β-actin）表达量为参比，用2-△△CT法计算目的基因相对表达量。

表2 引物序列

1.5.5 PI3K、Akt 蛋白表达量

1.5.5.1 组织处理把脾脏组织剪成细小的碎片，融解RIPA 裂解液，混匀，取适量裂解液，在使用前数分钟内加入1 mmol/LPMSF，1%蛋白酶和磷酸酶抑制剂制成混合液后置冰上，按RIPA 裂解液说明书处理，用玻璃匀浆器匀浆，提取总蛋白，取适量样品采用BCA 试剂盒测样品总蛋白浓度，剩余样品冷冻备用。

1.5.5.2 蛋白质免疫印迹检测 分别向每种样品添加SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（5X），95℃加热10 min使蛋白质变性，调整上样量为30 μg 进行电泳，浓缩胶（80 V，20 min），分离胶（120 V，40 min）。将PVDF 膜在浸活液中浸活1 min，蛋白质经电泳分离后，转移到PVDF 膜上（200 mA，4℃转膜60 min），转移后，取出PVDF 膜，用Tris-Hcl 缓冲液（TBST）漂洗3 次，每次5 min。封闭液封闭10 min，取出PVDF膜后用TBST 漂洗3 次，每次5 min。将其与1X 磷酸盐缓冲液（PBS）稀释的1 000 倍的1 抗结合，在摇床上4℃过夜孵育，取出PVDF 膜后用TBST 漂洗3 次，每次5 min。后与1X PBS 稀释3 000 倍的第2 抗体结合，在摇床上孵育2 h，再次用TBST 漂洗3 次，每次5 min。用超敏ECL 化学发光试剂盒显色，2 min 后置于荧光成像仪检测（Tanon 4 200）。用天能GIS 1D 分析软件分析。

1.6 统计分析 试验数据采用SPSS 22 软件单因素方差（One-Way ANOVA）程序进行单因素方差分析，差异显著性采用Duncan's 法进行多重比较，P＜0.05 时表示差异性显著，P＜0.01 表示差异性极显著，结果均以平均值±标准差表示。

2 结 果

2.1 乳酸菌发酵饲料和PI3K 阻断剂对雏鸡生长性能的影响 如表3 所示，ADG 和F/G 在4 组间均差异显著，ADG 为发酵饲料组＞对照组＞乳酸菌阻断剂组＞基础阻断剂组（P＜0.05），F/G 为发酵饲料组＜对照组＜乳酸菌阻断剂组＜基础阻断剂组（P＜0.05）。

表3 乳酸菌发酵饲料和PI3K 阻断剂对雏鸡生长性能的影响

2.2 乳酸菌发酵饲料和PI3K 阻断剂对雏鸡外周血淋巴细胞的影响 如表4 所示，发酵饲料组T、B 淋巴细胞转化率显著高于其余各组，对照组T、B 淋巴细胞转化率显著高于乳酸菌阻断剂组，乳酸菌阻断剂组T、B 淋巴细胞转化率显著高于基础阻断剂组。

表4 乳酸菌发酵饲料和PI3K 阻断剂对雏鸡外周血淋巴细胞转化率的影响 %

2.3 乳酸菌发酵饲料和PI3K 阻断剂对雏鸡血清细胞因子含量的影响 如表5 所示，IL-2、IL-6、IFN-α 水平在4 组间均为发酵饲料组＞对照组＞乳酸菌阻断剂组＞基础阻断剂组（P＜0.05）。各组其他指标无显著差异。

表5 乳酸菌发酵饲料和PI3K 阻断剂对雏鸡血清细胞因子含量的影响

2.4 乳酸菌发酵饲料和PI3K 阻断剂对雏鸡免疫球蛋白含量的影响 如表6 所示，IgA、IgM、IgG、NDV-Ab含量在4 组间均为发酵饲料组＞对照组＞乳酸菌阻断剂组＞基础阻断剂组（P＜0.05）。

2.5 乳酸菌发酵饲料对雏鸡脾脏PI3K 蛋白和脾脏Akt蛋白表达的影响 如图1、图2 和表7 显示，雏鸡脾脏PI3K、Akt 蛋白表达量在4 组间差异显著，均为发酵饲料组＞对照组＞乳酸菌阻断剂组＞基础阻断剂组（P＜0.05）。

表6 乳酸菌发酵饲料和PI3K 阻断剂对雏鸡免疫球蛋白含量和新城疫抗体含量的影响

图1 PI3K 蛋白电泳图

图2 Akt 蛋白电泳图

表7 乳酸菌发酵饲料对雏鸡脾脏PI3K、Akt 蛋白表达的影响

2.6 乳酸菌发酵饲料对雏鸡脾脏PI3K、Akt mRNA 表达的影响 如表8 所示，雏鸡脾脏PI3K、Akt mRNA表达量均为均为发酵饲料组＞对照组＞乳酸菌阻断剂组＞基础阻断剂组（P＜0.05）。

表8 乳酸菌发酵饲料对雏鸡脾脏PI3K、Akt mRNA 表达的影响

2.7 部分变量间相关性分析 由表9 可知，PI3K mRNA表达量与ADG、T 细胞转化率、B 细胞转化率、IL-6、IFN-α、IgM、NDV-Ab 含量呈显著正相关。Akt mRNA表达量与ADG、IFN-α 含量呈极显著正相关，Akt mRNA 表达量与T 细胞转化率、B 细胞转化率、IL-6含量、IgM、NDV-Ab 含量呈显著正相关。

3 讨 论

3.1 乳酸菌发酵饲料对雏鸡免疫功能影响 淋巴细胞是与动物体免疫活性极其相关的细胞，T 细胞反映机体细胞免疫活性，B 细胞反映机体体液免疫的活性。白细胞介素是可以由淋巴细胞产生并作用于淋巴细胞的一类细胞因子，它们在传递信息、激活与调节免疫细胞、介导T 和B 细胞活化、增殖与分化方面有重要的作用。其中IL-2 被称为T 细胞生长因子，它由T 细胞产生，同时又可以活化T 细胞来产生细胞因子。IL-6 可以由活化的T 细胞和B 细胞合成，能够刺激活化B 细胞增殖，分泌抗体，刺激T 细胞增殖。尹艳军等[7]研究发现，基础饲料分别添加1%和2%的乳酸冻干菌均能提高肉鸡T淋巴细胞转化率，促进免疫器官的生长发育。吴妍妍等[8]研究发现，用嗜酸乳杆菌发酵棉粕喂食AA 肉仔鸡，与对照组相比，AA 肉仔鸡血清中的IgA、IgM、IgG 均显著提高。本试验结果显示，乳酸菌发酵饲料提高了雏鸡T、B 淋巴细胞转化率，提高雏鸡IL-2、IL-6、IFN-α 含量，显著提高雏鸡体内免疫球蛋白IgA、IgM、IgG、NDVAb 含量，表明乳酸菌发酵饲料可提高雏鸡体液免疫和细胞免疫功能。其可能机制为乳酸菌改善了雏鸡肠道环境，增强了其对饲料的消化吸收能力，促生长能力明显；乳酸菌通过与肠道内其他菌群的生存竞争，减少和抑制了雏鸡肠道内的有害菌，使得雏鸡抗菌抗病能力增强。

3.2 乳酸菌发酵饲料调控体液免疫和细胞免疫的机制PI3K/Akt 信号通路是一条经典的信号通路，在细胞存活与分化、细胞生长、运动和凋亡等多种生理和病理过程中起作用。近年来通过基因敲除、药物干预及体外细胞研究等技术发现PI3K 参与T 细胞的发育、活化、增殖及分化，并且研究证明PI3K 信号在T 细胞发育的多个阶段起重要作用[9]。T 细胞可能产生或者促进产生一些细胞因子（如IL-2），它可以促进B 细胞增殖和分泌抗体。张彤瑶[10]研究发现，金针菇菇脚通过激活PI3K/Akt 信号通路增强了肉鸡免疫功能。本试验给雏鸡饲喂基础饲料或乳酸菌发酵饲料，在口服PI3K 阻断剂时，均显著降低雏鸡PI3K、Akt mRNA 和蛋白的表达以及雏鸡体液免疫和细胞免疫水平。通过变量间相关性分析结果可知，PI3K mRNA 表达量与雏鸡平均日增重、T 细胞转化率、B 细胞转化率、IL-6、TFN-α、IgM、NDV-Ab 含量呈显著正相关。Akt mRNA 表达量与日增重、IFN-α 含量呈极显著正相关，Akt mRNA表达量与T 细胞转化率、B 细胞转化率、IL-6 含量、IgM、NDV 抗体含量呈显著正相关。其可能机制为乳酸菌激活了PI3K/Akt 信号通路，刺激B、T 淋巴细胞的增殖，因此增强了动物体免疫功能。

表9 部分变量间相关性分析

4 结 论

本试验结果表明，乳酸菌发酵饲料可以提高SPF鸡体液免疫和细胞免疫功能，主要是通过激活SPF 鸡PI3K/Akt 信号通路来提高机体的免疫功能。