IP3R1 基因表达、变异对蛋鸭蛋壳品质的影响

覃媛钰，陈滇黔，罗华伦，吴 磊，张依裕*

（1.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025；2.高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州贵阳 550025）

1，4，5-三磷酸肌醇受体（Inositol 1，4，5-Trisphosphate Receptors，IPTRs，IP3Rs）是广泛分布于动物和人类各组织细胞中的一类跨膜蛋白，它是内质网膜上调节钙离子从内质网释放的一个IP3-门控通道[1]。目前已鉴定了3 种亚型，即IP3R1、IP3R2 和IP3R3[2]。IP3Rs在Ca2+信号通道中发挥着重要作用，用于信号转导的Ca2+主要来源于内质网/肌浆网中的内部储存库，其中肌醇-1，4，5-三磷酸受体或兰尼碱受体调节Ca2+的释放。大量研究显示，IP3R1 与肿瘤、休克、肥胖、弥漫性轴索损伤等疾病相关[3-5]。Chai 等[6]报道，DEX 介导的IP3R1 通过糖皮质激素反应元件与近端IP3R1 基因启动子中GRE 的相互作用来影响猪肌肉细胞内Ca2+浓度的不平衡。Wang 等[7]研究发现，肿瘤坏死因子-α能增加GMC 中IP3R1 基因的表达，并增加特异性蛋白1对IP3R1 基因启动子的Ca2+释放和结合活性。Zhao 等[8]评估了IP3R1 复合物的结构和功能，发现其参与炎症损伤期间Ca2+稳态的调节过程。目前，通过多个数据库检索证明IP3R1 基因与人类疾病密切相关，但关于IP3R1 基因在畜禽生产性能及其调控机制方面的报道极为少见。钙质沉积对蛋壳的构造起决定性作用，因此，探明机体内与Ca2+信号通路有关的基因对蛋壳品质的形成有重要意义。本实验通过探究鸭IP3R1 基因变异、表达对蛋鸭蛋壳品质的影响，旨在为进一步探明该基因在家鸭中的生物学功能和评价其多态性的育种价值提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料 选取单笼饲养、健康无病的产蛋中期（43周龄）三穗鸭54 只，逐只收集产蛋记录，翅静脉采血1～1.5 mL，-20℃保存待用；采血后屠宰6 只，无菌采取肺、心脏、肌胃、胸肌、肝、胰腺、肾、腺胃、子宫、小肠和脾脏11 个组织，-80℃冰箱保存待用。

1.2 蛋壳品质检测、基因组DNA、总RNA 提取及cDNA合成 蛋壳品质测定参照《家禽生产学》[9]中的方法执行。所有三穗鸭个体的基因组DNA 按照QlAamp DNA Mini Kit（50）提取试剂盒（购于天根生物科技有限公司）操作说明书进行提取，总RNA 提取按照Trizol 试剂盒（购自北京康为世纪生物科技有限公司）操作说明书的步骤对每个个体的每个组织进行提取，采用1%琼脂糖凝胶电泳和核酸浓度测定仪检测后稀释成100 ng/μL。cDNA 合成按照2×T5Fast qPCR Mix（SYBR Green I）Master Mix（购自北京康为世纪生物科技有限公司）操作说明进行合成。

1.3 引物设计 根据GenBank 数据库登录鸭IP3R1 基因序列（NW_004677051.1）和鸭β-Actin 基因序列（EF667345），运用Primer Premier 5.0 设计3 对引物：P1 引物扩增区域g.256734-g.257578，位于第18 内含子内；P2 引物扩增区域g.253551-g.254386，位于部分外显子14 到部分内含子15；目的基因表达引物IE 和内参基因表达引物AE，序列信息见表1，由上海英潍捷生物技术公司合成。

1.4 IP3R1 基因表达检测 采用常规PCR 检测IP3R1 基因和β-Actin 基因表达引物的特异性，反应总体积20 μL：RNase-Free Water 7 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上游引物、下游引物和DNA（10 pmol/μL）各1 μL；PCR 反应程 序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，30 个循环，采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

以β-Actin 基因作为内参对照，实时荧光定量PCR 检测IP3R1 基因在各组织中的表达程度。实时荧光定量PCR反应体系：2×Ts Fast qPCR Mix 5 10 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各0.8 μL，H2O 补足20 μL。每个样品设置3 个重复，IP3R1 基因反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，60.0℃退火延伸30 s，共39 个循环。

1.5 IP3R1 基因多态性检测 对IP3R1 基因的多态性进行PCR 扩增，反应体积为20 μL，反应体系同1.4，反应程序：94℃预变性8 min；94℃变性50 s，退火50 s，72℃延伸60 s，35 个循环。扩增产物用1%琼脂糖凝电泳检验，切胶回收送上海英潍捷生物技术公司进行测序。

1.6 统计分析 应用生物分析软件DNAstar 中的EditSeq和MegAlign 程序，结合Chromas 软件对测序结果序列进行比对，查找SNP 位点，计算每个位点的基因型频率、等位基因频率、有效等位基因数（Ne）、遗传杂合度（He）、多态信息含量（PIC）和Hard-Weinberg 平衡；同时查找其SNP 位点用Excel 2013 处理分析数据，采用公式2-△△Ct计算IP3R1 基因在各个组织中的相对表达量；采用SPSS 16.0 软件中一般线性模型分析IP3R1 基因各多态位点与蛋品质的显著性差异，结果用平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 IP3R1 基因表达引物和多态性引物的特异性检测由图1 和图2 可知，4 对引物的PCR 产物条带与预期片段相符，清晰明亮，通过测序表明目的片段与GenBank登录序列相一致，可用于基因的表达和多态性分析。

图1 IE 和AE 表达引物PCR 检测

图2 P1 和P2 多态引物PCR 检测

表1 引物序列

2.2 IP3R1 基因实时荧光定量PCR 检测 由图3 和图4可见，分别扩增β-Actin 和IP3R1 基因的表达引物AE和IE 的荧光定量PCR 检测结果表现出扩增曲线、熔点曲线和熔解峰结果优良，可用于实时荧光定量分析。

如图5 显示，IP3R1 基因mRNA 在产蛋中期三穗鸭11 个组织中均存在不同程度的表达，除胸肌和肌胃、子宫和腺胃、小肠和脾脏、 胰腺和肝脏的mRNA 表达量差异不显著外，其他各组织间mRNA 表达量达到显著差异（P＜0.05），其中肺、心脏、肌胃和胸肌呈高度特异表达，肝脏、胰腺、肾脏呈中度表达，其他组织呈相对低的表达丰度，总体表达量的顺序依次为肺＞心脏＞肌胃＞胸肌＞肝＞胰腺＞肾＞腺胃＞子宫＞小肠＞脾脏。

2.3 IP3R1 基因多态性检测 由图6 可知，在IP3R1 基因内含 子 14 发 现g.253779 T＞C 、g.253967 C＞A 2 个SNPs，其中g.253779 T＞C产生TT、TC和CC 3种基因型；g.253967 C＞A 产生CC、CA 和AA 3 种基因型。在IP3R1 基因内含子18 发现g.257089G＞A、g.257159C＞G 、g.257237T＞G共3 个SNPs，其中g.257089G＞A，检测到GG 和GA 2 种基因型；g.257159C＞G，检测到CC 和CG 2 种基因型；g.257237T＞G，检测到TT、TG 和GG 3 种基因型。

2.4 IP3R1 基因多态位点遗传多样性分析 由表2 可知，g.253779 T＞C、g.253967 C＞A、g.257089G＞A、g.257159C＞G和g.257237T＞G 的优势基因型分别为TC、CC、GA、CC和TT，其频率分别为0.389、0.481、0.722、0.611 和0.389，优势等位基因分别为T、C、G、C 和T，其频率分别为0.528、0.666、0.639、0.806 和0.556；5 个SNPs 位点的PIC 均在0.25～0.50，表明5 个多态位点均为中度多态位点；卡方（χ2）检验表明，除g.257089G＞A 位点外，其于4 个SNPs 位点的基因型分布均未偏离Hard-Weinberg 平衡。

2.5 IP3R1 基因多态位点与鸭蛋壳品质的关联性分析如表3 结果显示，g.257159C＞G 位点对蛋重和蛋壳重的影响均达极显著和显著水平，CC 基因型个体的蛋重和蛋壳重极显著或显著低于CG 基因型个体；g.257237T＞G位点对蛋形指数的影响达显著水平，TG 基因型个体的蛋形指数显著低于TT 和GG 基因型个体；其他各位点不同基因型蛋壳性状指标间的差异未达到显著水平。

图3 AE 引物荧光定量PCR 检测

图4 IE 引物荧光定量PCR 检测

图5 IP3R1 基因组织表达谱

图6 IP3R1 基因测序比对

表2 IP3R1 基因SNPs 遗传多样性

3 讨 论

优质的蛋壳品质不仅能够减少鸭蛋在加工过程中的损失，更重要的是可以有效防止细菌污染蛋品。蛋壳主要由碳酸钙结晶构成，因此在整个蛋壳形成过程中，Ca2+作为生物体内重要的信号分子发挥着重要作用[10]。目前，对IP3R1 的报道主要集中在人类疾病和小鼠模型上[11-13]，而IP3R1 在畜禽上的研究相对较少。Sun 等[14]报道，cADPR 通过IP3Rs 通道激活内质网上贮存的Ca2+释放到细胞质进而影响家禽蛋品品质。Liu等[15]报道，G 蛋白偶联受体P2RY2 在生产不同蛋壳强度的蛋鸡子宫组织内差异表达，可能通过激活PLC触发IP3，激活IP3Rs 介导胞内Ca2+释放。PLC 作为IP3R1 的上游基因催化磷脂酰肌醇4，5-二磷酸裂解成二酰基甘油和IP3，其扩散到胞质溶胶中并激活其受体通道IP3R[16]。Zhang 等[17]研究表明，IP3Rs 对鸡的蛋壳厚度和强度有显著影响。本实验结果表明，IP3R1 基因在三穗鸭在不同组织之间的表达差异较大，其中在鸭的肺、心脏、肌胃和胸肌中为高度特异表达，肝脏、胰腺、肾呈中度表达，其他组织呈相对低的表达丰度，推测IP3R1 的特异性表达可能导致该基因在鸭机体各组织中的功能特异性。前人研究显示[18]，IP3Rs 是神经细胞内主要存在的亚型，在整个中枢神经系统内均有表达，目前未检索到IP3R1 基因的组织表达。本研究对三穗鸭IP3R1 基因的g.256734～g.257578 和g.253551～g.254386区域进行SNPs 检测，共查找出5 个SNPs 位点13 个基因型，5 个SNPs 位点优势基因型分别为TC、CC、GA、CC 和TT，其频率分别为0.389、0.481、0.722、0.611和0.389，PIC 均在0.25～0.50，为中度多态位点，表明三穗鸭的突变位点均有较稳定的遗传力，具有育种选择潜力；g.257089G＞A 位点严重偏离了Hardy-Weinberg平衡，这与三穗鸭的长期人工选育有关，而g.257089G＞A位点的基因型GA 高于其他几个位点的基因型，更好地验证了GA 基因型的优势性。其余4 个SNPs 位点的基因型分布均未偏离Hard-Weinberg 平衡，说明其位点可能经历了长期育种选择后重新达到了Hardy-Weinberg平衡状态，很好地适应了产地的生活环境，形成了优质的鸭品种。

表3 IP3R1 基因5 个SNPs 位点与三穗鸭蛋品质的关联性分析

Duan 等[19]选择了15 个离子转运基因中的99 个SNPs 进行基因分型，结果发现ATP2A3、ITPR1、SLC8A3、SCNN1a 可以作为蛋壳质量遗传改良的基因。冯静等[20]研究指出，蛋重和蛋壳品质是衡量蛋壳品质的重要指标。本研究结果表明，g.257159C＞G 位点对蛋壳重的影响达到显著水平，其CG 基因型更有利于三穗鸭蛋壳的形成；g.257237T＞G 位点对蛋形指数的影响达到显著水平，正常鸭蛋的蛋形指数一般在1.3～1.4，适宜的蛋形指数能够提高孵化率和减少破损[21-22]，因此在育种选择时可将TT 和GG 基因型作为主要的优势基因型，尽可能选择蛋形指数优良的品系，以保持三穗鸭的优良遗传性状。综合研究结果可知，在5 个SNPs 位点中，g.257159C＞G 和g.257237T＞G 的突变对蛋形指数、蛋重和蛋壳重有显著性影响，说明这2 个位点对鸭蛋壳品质的质量有重要意义，可将这2 个位点作为三穗鸭蛋壳品质的分子辅助选择的候选标记位点，也为今后选育高质量的产蛋鸭提供科学依据。为获得真实可靠的分子遗传标记，下一步还应该扩大筛查范围、增加研究的样本数，观察IP3R1 基因其他区段的多态性是否也对蛋壳形成有一定影响。