二乙基二硫代氨基甲酸铜纳米核脂质体的制备与工艺优化

孔艺涵，梁 雪，张 宇



二乙基二硫代氨基甲酸铜纳米核脂质体的制备与工艺优化

孔艺涵，梁 雪，张 宇*

（沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016）

为临床提供可静脉注射的二乙基二硫代氨基甲酸铜（Cu(DDC)2）纳米核脂质体。采用反向微乳液聚合-薄膜水化法制备Cu(DDC)2纳米核脂质体，以粒径及包封率作为评价指标，对处方工艺进行优化，在最佳处方的基础上，对制剂的冻干工艺进行考察。Cu(DDC)2纳米核脂质体最佳处方与工艺为：水相药物加入到8 mL体积比为71∶29的环己烷-Igepal CO-520中分别制备CuCl2及二乙基二硫代氨基甲酸钠（DDTC）反相微乳，将上述反相微乳混合后采用异丙醇破乳，通过高速离心的方法收集Cu(DDC)2纳米粒。用氯仿和乙醇混合溶液将DOPA-Cu(DDC)2纳米粒重新分散后，加至含有（2,3-二油酰氧基-丙基）三甲基氯化铵[(2,3-dioleoyloxy-propyl)-trimethylammonium chloride，DOTAP]、胆固醇和DSPE-PEG2000的乙醇溶液中，通过薄膜水化法制备最终的Cu(DDC)2纳米核脂质体。该处方工艺可行，冻干后的制剂可以长期储存，为Cu(DDC)2日后的注射给药进一步打下基础。

药剂学；脂质体；反相微乳液聚合法；薄膜水化法；二乙基二硫代氨基甲酸铜；油水难溶性药物

双硫仑（disulfiram，DSF）从戒酒药到抗肿瘤药物的转型研究已经多年，研究人员发现DSF与肿瘤细胞内的铜离子形成的二乙基二硫代氨基甲酸铜（Cu(DDC)2）能够抑制26S蛋白酶体的活性[1]，从而间接阻断NF-κB通路[2]，抑制NF-κB表达，诱导肿瘤细胞凋亡，同时抑制肿瘤细胞的生存、增殖和转移[3]。

目前有关Cu(DDC)2的制剂较少，这与Cu(DDC)2本身的理化性质有关。因其水溶性极差，在水中溶解度小于1 mg∙L-1，各种表面活性剂对其增溶作用也不显著，另外Cu(DDC)2脂溶性也较差。目前文献报道的制备Cu(DDC)2脂质体方法为预先制备含CuSO4的脂质体，加入二乙基二硫代氨基甲酸钠（DDTC）孵育[4]，但是这种方法包封率较低，药物容易泄露。其他的Cu(DDC)2制剂报道为将Cu(DDC)2制备成白蛋白纳米粒或疏水蛋白纳米粒，但是白蛋白类原料比较昂贵，且不易获得。为了提高Cu(DDC)2的包封率，本文作者采用反向微乳液聚合-薄膜水化法制备Cu(DDC)2纳米核脂质体，先制备1,2-二油酰--甘油-3-磷酸（钠盐）（1,2-dioleoyl--glycerol-3-phosphate sodium salt，DOPA）包裹的Cu(DDC)2纳米粒，再用外层磷脂进行包裹，制备Cu(DDC)2纳米核脂质体，提高药物的包封率，为Cu(DDC)2日后的注射给药打下基础。

1 仪器与材料

EYELA OSB-2000旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司），Scientz-IIE超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司），ATL-124分析天平（赛多里普斯科学仪器有限公司），HC-3018R低温冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司），PF-101T 集热式恒温磁力搅拌（巩义市英峪予华仪器厂），D/Max 2500 PC X-ray diffractomer (Rigaku, Japan)，JEM-2100 透射电子显微镜（日本电子，JEOL），Nano-ZS-ZEN3700马尔文粒度测定仪（英国马尔文公司）。

注射用胆固醇、（2,3-二油酰氧基-丙基）三甲基氯化铵[(2,3-dioleoyloxy-propyl)-trimethylammonium chloride，DOTAP]、DSPE-PEG2000（上海艾伟拓医药科技有限公司），二乙基二硫代氨基甲酸钠三水合物（DDTC）、壬基酚聚氧乙烯醚（Igepal®CO-520）（Sigma-Aldrich），1,2-二油酰--甘油-3-磷酸（钠盐）（DOPA，上海东尚医药科技有限公司），环己烷、无水乙醇、异丙醇（分析纯，天津康科德科技有限公司），氯化铜（分析纯，天津博迪化工股份有限公司），Tritonx-100（国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：迪马C18柱（200 mm× 4.6 mm，5 µm）；流动相：乙腈-水（体积比80∶20）；检测波长：435 nm；流速：1.0 mL∙min-1；柱温：25 ℃；进样量：20 µL。

2.2 Cu(DDC)2在常用有机溶剂中的溶解度测定

分别取Cu(DDC)2100 mg （过量）加入2 mL下述常用有机溶剂中（环己烷、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃、乙醇、乙醚、甲基叔丁基醚、丙酮、二甲基亚砜、,-二甲基甲酰胺、甲苯、异丙醇、乙腈、甲醇、乙酸乙酯、丙二醇），并置于西林瓶中磁力搅拌分散，充氮气后密封于37 ℃恒温摇床中放置72 h达到溶解平衡后，将各样品于1.2×104r∙min-1离心5 min，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液进行测定或经定量稀释后利用液相测定，计算溶解度[5]，结果见图1。

Fig. 1 Solubility of Cu(DDC)2 in common organic solvent

图1结果表明，Cu(DDC)2在常用的各有机溶剂中溶解度均较差，在氯仿、二氯甲烷、,-二甲基甲酰胺中略大，在其余有机溶剂中均较小，而且四氢呋喃会使Cu(DDC)2降解，在后续制备制剂过程中予以重视。

2.3 Cu(DDC)2纳米核脂质体的制备

将500 mmol∙L-1DDTC水溶液150 μL、20 g∙L-1DOPA氯仿溶液320 μL加入到8 mL环己烷- Igepal CO-520（体积比71∶29）中制备DDTC反相微乳；另将500 mmol∙L-1CuCl2水溶液150 μL加入到相同的油相中制备CuCl2反相微乳。两个微乳混合搅拌24 h，加入异丙醇16 mL进行破乳，以1.750 0×104g离心30 min收集得到DOPA-Cu(DDC)2纳米粒。采用异丙醇洗涤表面过量的环己烷及表面活性剂，N2吹干。用氯仿300 μL和乙醇900 μL的混合溶液将DOPA-Cu(DDC)2纳米粒重新分散，离心除去大粒子，加入20 mmol∙L-1DOTAP 300 μL、20 mmol∙L-1胆固醇300 μL、20 mmol∙L-1DSPE-PEG2000的乙醇溶液150 μL，65 ℃旋转蒸发除去有机溶剂，形成薄膜，加入65 ℃预热去离子水5 mL，于380 W功率下进行探头超声，得Cu(DDC)2实心核脂质体。

2.4 Cu(DDC)2纳米核脂质体的制备-处方工艺筛选

2.4.1 表面活性剂的筛选

本文作者考察了Tritonx-100以及IgepalCO-520作为表面活性剂制备的反相微乳液的性质，结果见表1。结果表明Igepal CO-520的表面活性优于Tritonx-100，且制备的空白反相微乳液粒径更小，因此选取Igepal CO-520作为表面活性剂。

Table 1 Screeningofsurfactant(blank reverse microemulsion particle size

2.4.2 反相微乳液拟三元体系相图的绘制

将表面活性剂Igepal CO-520与油相环己烷按不同的质量比(分别为0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0)每份共10 g配成一系列的拟二组分体系，将上述二组分体系在25 ℃的恒温槽中恒温搅拌，待油相与表面活性剂形成均一相，开始加入去离子水至反应体系由澄清变浑浊即为反相微乳区临界点，记录加入去离子水的质量，分别计算三相在体系中的质量分数，在Origin软件中绘制拟三元相图[6]，结果见表2和图2。

图2结果表明，当Igepal CO-520与油相环己烷的质量比大于1∶1时，Igepal CO-520过多导致三元体系过于黏稠，且体系的容水量较小，因此制备反相微乳时Igepal CO-520与油相环己烷的质量比应小于1∶1。

Table 2 Phase vanishing point composition of phase diagram of microemulsion region in different Igepal CO-520/cyclohexane mass ratio ternary system

Fig. 2 Pseudo-ternary phase diagrams of system composed by destilled water, cyclohexane and Igepal CO-520

2.4.3 破乳剂的筛选

为了收集DOPA包裹的Cu(DDC)2纳米粒，需要将反相微乳破坏，通过高速离心的手段获得[7]。筛选合适的破乳剂对下一步的制备至关重要，破乳剂首先需要能够与环己烷互溶以破坏反相微乳，且Cu(DDC)2在破乳剂的溶解度要尽可能小。本文作者筛选了甲醇、乙醇、异丙醇、丙二醇作为破乳剂，结果见表3。

Table 3 Screening of demulsifier

筛选结果显示，丙二醇作为破乳剂可以收集到更多的DOPA包裹的Cu(DDC)2纳米粒，但是会引起纳米粒的聚集，导致粒径增大，其余3种醇作为破乳剂效果类似，因Cu(DDC)2在异丙醇中溶解度最小，最终确定异丙醇作为破乳剂。

2.4.4 DOPA-Cu(DDC)2分散介质

为了进行外层磷脂的包裹，需要分散DOPA包裹的Cu(DDC)2纳米粒，采用氯仿-乙醇混合溶剂作为分散介质，并对氯仿-乙醇的比例进行了考察，结果见表4。

Table 4 Screening of the ratios of chloroform to ethanol

结果表明，氯仿与乙醇的体积比为1∶3时，制备得到的Cu(DDC)2纳米核脂质体粒径最小，分布最均匀，增大氯仿或乙醇在混合溶液中的比例，均会导致粒径增大，因此最终确定氯仿与乙醇的体积比为1∶3。

2.4.5 磷脂用量的考察

实验中发现，当磷脂的用量为20～60 g∙L-1时所制备的脂质体较稳定。脂质体的粒径随着磷脂用量的增加而增大，并且当磷脂的用量增加到80 g∙L-1以上，脂质体在显微镜下可以观察到磷脂块，说明磷脂为过量。因此，本项研究中分别考察了磷脂用量为20、40和60 g∙L-1时对脂质体粒径及粒度分布及包封率的影响。实验结果表明，当磷脂质量浓度为60 g∙L-1时，所制备的脂质体粒度分布均一、包封率高。因此，磷脂的最终用量确定为60 g∙L-1。

2.5 包封率的测定

取脂质体溶液2 mL置于离心管中，6 000 r∙min-1离心10 min，除去下层未包封的药物沉淀，游离于溶液中的药物分子忽略不计。取上层溶液0.5 mL，加入异丙醇4 mL，涡旋10 min，6 000 r∙min-1离心10 min，取上清液测定含量为d，药物总量为加入的理论量t。包封率EE=d/t×100%。结果显示 Cu(DDC)2纳米核脂质体的平均包封率为74%。

为了保证包封率测定方法的准确性，同时进行了游离Cu(DDC)2溶液加入到Cu(DDC)2纳米核脂质体中的回收率测定。每3个为一组分别加入本底浓度80%、100%和120%的对照溶液，按前面所述方法进行操作，计算回收率，结果见表5。

Table 5 Recovery tests of Cu(DDC)2

回收率结果表明，此方法适用于Cu(DDC)2纳米核脂质体包封率的测定。

2.6 X-射线粉末衍射分析

为了验证带有负电荷的DOPA磷脂是否可以与过量的Cu2+结合从而实现对Cu(DDC)2的包裹，分别对Cu(DDC)2原料药、DOPA-Cu(DDC)2纳米粒、DOPA磷脂以及DOPA与Cu(DDC)2原料药的物理混合物进行粉末衍射分析。衍射角度3°~50°，以每秒0.05°的速率进行扫描，绘制XRD图谱。从图3看出，原料药Cu(DDC)2具有较多尖锐的特征衍射峰，即10.2°、11.8°、12.4°等[8]，DOPA与Cu(DDC)2原料药的物理混合物仍具有Cu(DDC)2的一部分特征峰。而被DOPA磷脂包裹后，各个特征峰消失，验证了DOPA磷脂对Cu(DDC)2的包裹。

▬—Cu(DDC)2; ▬—DOPA+Cu(DDC)2; ▬—DOPA coated Cu(DDC)2; ▬—DOPA

2.7 Cu(DDC)2纳米核脂质体的表征

Cu(DDC)2纳米核脂质体形态采用质量分数2%磷钨酸负染法用透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）进行观察，加速电压200 kV，放大倍率80 000X，结果见图4。结果显示，Cu(DDC)2纳米核脂质体为球形纳米粒子，表面规整，粒径分布比较均匀。

Fig. 4 TEM analysis of Cu(DDC)2 solid nuclear liposome

2.8 Cu(DDC)2纳米核脂质体冻干保护剂的考察

采用如图5所示冻干曲线对冻干保护剂进行筛选。首先对单一冻干保护剂进行考察，量取Cu(DDC)2纳米核脂质体2 mL，分别加入不同量的蔗糖、乳糖、甘露醇、海藻糖、环糊精、麦芽糖和葡萄糖粉末，冷冻干燥结束后，观察其外观，并用相同体积的纯净水复溶，结果见表6。

Fig. 5 Description of freeze-drying curve

Table 6 Effect of different cryoprotectants on the freeze-dried products

Notes: a﹢—Compacted cake, a﹣—Eruption and non-cake; b﹢—Easy, b﹣—Hard; c﹢—＜350 nm, c﹣—Microscale

结果显示，用葡萄糖、乳糖、麦芽糖冻干后外观有坍塌、萎缩等现象；用环糊精、蔗糖冻干后加蒸馏水复溶成原体积，振摇均匀，都不能很快分散成均匀的纳米粒混悬液，都存在不同程度的大粒子聚集现象。从冻干后外观及再分散性能看，甘露醇及海藻糖对制剂保护作用明显。

单一冻干保护剂复溶后粒径不能满足要求，因此考虑使用海藻糖和甘露醇作为复合冻干保护剂对制剂的保护效果，分别考察不同比例的海藻糖及甘露醇作为复合冻干保护剂，冷冻干燥结束后，用相同体积的纯净水复溶，测定粒径，结果见表7。

Table 7 Effect of different combination of cryoprotectant on the freeze-dried products

从复溶结果来看，以粒径及分散系数PDI综合考虑，质量分数5%甘露醇+质量分数5%海藻糖对制剂的保护效果最好，拟采用质量分数5%甘露醇+质量分数5%海藻糖作为最终复合冻干保护剂。

3 讨论

a. 反相微乳液为一种不同于常规的微乳液体系，油相及表面活性剂占绝大比例，而水相只有很小的比例，反相微乳液的水相在微乳液中形成几纳米到几十纳米的“微水池”，两个反相微乳液的水相经过离子交换反应可以在微水池中反应形成粒径可控的产物。

b. Cu(DDC)2为双硫仑与铜离子螯合的产物，也可以为双硫仑在体内的代谢产物DDTC与铜离子螯合形成。Cu(DDC)2水溶性极差，在水中溶解度小于1 mg∙L-1，各种表面活性剂对其增溶作用也不显著，另外Cu(DDC)2脂溶性也较差，导致常规剂型无法制备粒径可控的Cu(DDC)2制剂。

c. 因双硫仑为水不溶性的药物，所以采用水溶性的DDTC制备反相微乳。通过制备CuCl2反相微乳及DDTC反相微乳，两个反相微乳液的混合会使得水相中的药物在微反应池中通过离子交换形成Cu(DDC)2，而铜离子的过量加入会与微乳中带负电荷的磷脂DOPA结合，从而实现DOPA对Cu(DDC)2的包裹，制备粒径可控的DOPA包裹的Cu(DDC)2纳米粒。进一步通过薄膜水化法，加入带正电荷的磷脂DOTAP，从而实现磷脂的双层包裹，得到最终的Cu(DDC)2纳米核脂质体。

4 结论

作者通过反相微乳聚合-薄膜水化法成功制备了Cu(DDC)2纳米核脂质体，制备得到的脂质体粒径分布均匀，包封率高，复溶性能良好，不仅为Cu(DDC)2日后的注射给药打下基础，而且也为其它油水均难溶性药物制剂的研究提供了有益参考。

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Preparation and process optimization of solid core liposomes of copper diethyl dithiocarbamate

KONG Yihan, LIANG Xue, ZHANG Yu*

(,,110016,)

To provide clinically available intravenous copper diethyl dithiocarbamate (Cu(DDC)2) nanonuclear liposomes.Cu(DDC)2nano-nuclear liposomes were prepared by reverse microemulsion polymerization-film hydration method. The particle size and encapsulation efficiency were used as evaluation indexes to optimize the formulation process. On the basis of the best prescription, the lyophilization process of the formulation was investigated.The optimal formulation and process of Cu(DDC)2nano-nuclear liposome were as follows: the aqueous phase drug was added to 8 mL of cyclohexane-Igepal CO-520 (∶=71∶29) to prepare CuCl2reverse microemulsion and sodium diethyl dithiocarbamate (DDTC) reverse microemulsion. The inverse microemulsion was mixed and emulsified with isopropyl alcohol. And Cu(DDC)2nanoparticles were collected by high speed centrifugation. The DOPA-Cu (DDC)2nanoparticles were redispersed with a mixed solution of chloroform and ethanol, and the solution of DOTAP, cholesterol the DSPE-PEG2000 in ethanol was added. The final Cu(DDC)2nano core liposome was prepared by thin film hydration.The prescription process is feasible, and the lyophilized preparation can be stored for a long time, which further lays a foundation for the injection of Cu (DDC)2.

pharmaceutics; liposome; reverse microemulsion polymerization; thin film hydration; Cu(DDC)2; oil-water insoluble drugs

2019-03-23

辽宁省自然科学基金资助项目(20180551031)

孔艺涵(1994-), 男(汉族), 辽宁沈阳人, 硕士研究生, E-mail 605452698@qq.com;

张宇(1982-), 男(汉族), 吉林四平人, 副教授, 博士, 硕士生导师, 主要从事药物新剂型研究, Tel. 024-43520558, E-mail zywinner01@ 163.com。

R94

A

（2019）04–0091–09

10.14146/j.cnki.cjp.2019.04.001

(本篇责任编辑：赵桂芝)