血液透析系统内毒素检测及其浓度含量控制*

王苏湘 滕朝宇 吴 瑕 王 宇

据中国医院管理协会2008年年底统计，我国大陆地区共有102863例慢性透析患者，患病率为79.1/100万人口，年患病率为52.9%，其中有89.5%的患者接受血液透析治疗[1]。2017年8月4日第九届中国血液净化论坛报告表明，目前我国慢性肾脏病患者超过1.2亿，其中3期以上约1800万(占0.13%)。原国家卫计委“鼓励独立的血透中心开展血液透析治疗”的文件发布以来，开展血液透析治疗的机构快速增加，保障治疗安全等工作迫在眉睫。

开展血透治疗时，透析液的配制、透析机的冲洗、透析器及血路管道用水都要求使用无菌的去离子反渗透(reverse osmosis，RO)水，即透析用水。传统透析治疗需要水120～180 L，高通量透析会消耗更多的水，而透析用水的水质直接关系到透析的远期效果[2]。为避免不合格水质对患者的不良反应，透析用水必须严格进行质量控制。否则，一旦细菌或化学性物质进入人体会引起并发症，透析用水的卫生质量关系到众多肾功能衰竭患者的身体健康和生存质量。因此，微生物及内毒素污染的防控、规范透析用水、透析浓缩液和透析液的质量十分重要。

1 内毒素与血液净化

内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁结构中的类脂多糖体(脂多糖)，在细菌死亡后裂解释放出来。内毒素能与血管壁细胞膜结合，改变血管通透性，使血压下降导致休克。内毒素水解后可以穿过透析膜进入到患者的体内，导致急性热源性反应，使患者产生低血压、肌肉痉挛、头痛及发热等症状，严重的可导致休克或内毒素血症[3]。

1.1 内毒素与鲎试剂法

鲎试剂法是目前测定内毒素的主要方法，该方法检测内毒素特异性强、灵敏度高且操作方法简便，美国药典(USP)和中国药典(CP)均已收载[4]。检测方法有凝胶法和光度测定法，光度测定法又包括浊度法和显色基质法。鲎试剂中的C因子能够与内毒素反应，激活B因子，活化后的B因子使凝固酶原变成凝固酶，凝固蛋白原在凝固酶的作用下形成凝固蛋白，最终形成凝胶。

1.2 内毒素污染来源

与透析有关的内毒素污染来源[5]主要包括以下4个方面。

(1)水前处理系统。透析用水的处理系统包括沉淀过滤器、软水器、活性碳过滤器等水质前处理系统，以及逆渗透膜系统或去离子器和超过滤器等。

(2)反渗水输送管道。管径大小、材质和结构的不同会造成细菌滋生，甚至会形成生物膜附着在管路的表面而有利细菌的滋生，污染复用用水。

(3)透析浓缩液配制的过程环节，透析浓缩液的污染，重碳酸盐透析液非常容易滋长细菌。

(4)透析机的污染，上下机及两班连台之间的消毒控制。

1.3 内毒素超标的临床表现

血液透析设备系统消毒过程中透析用水、透析浓缩液及透析液内毒素超标会将内毒素带入尿毒症患者血液，导致尿毒症患者产生内毒素血症。内毒素作用于吞噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞、血小板、补体系统以及凝血系统，并诱生肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-a)、白细胞介素-1(interleukin，IL-1)、IL-6和IL-8、组胺以及激肽等生物活性物质，使组织器官毛细血管灌注不足，出现缺氧及酸中毒等。高浓度的内毒素也可激活补体替代途经，引发高热、低血压以及活化凝血系统，最后导致弥散性血管内凝血。严重时可导致微循环衰竭和低血压为特征的内毒素休克甚至死亡。发现后要检查原因，感染者应给予抗感染治疗[6-7]。

2 研究材料与方法

应用戴明循环(plan do check action，PDCA)动态循环方法管理血液透析内毒素浓度含量控制过程，制定有效管控计划，严格执行，对出现的问题应具备解决方案和处理措施；并形成记录，实现菌毒共控、医疗安全的目的[8-9]。

2.1 检测样本及样品收集

(1)采集2014年1月至2017年8月常德职业技术学院附属第一医院血液净化中心的透析用水、透析浓缩液及透析液检测样本。

(2)将透析浓缩液连接至血液透析机，机器进入自检状态。待血液透析机的自检程序结束以后，安装一次性透析器和透析管路，将透析液快速接头按照要求连接到透析器，透析液由下向上进入透析器；关闭透析液，取下透析器透析液入口的快速接头。将快速接头开口向上，打开透析液开关后透析液自然流出。将取样吸管或注射器插到快速接头底部取样，注意吸头不可碰到快速接头密封圈外侧。透析用水及透析浓缩液采样，用络合碘擦拭控制阀出液口，冲洗干净后再提取供试样本。

2.2 仪器与试剂

采用ELx808IULALXH型鲎试验微生物快速检测仪(美国威诺斯基Bio-Tek公司)；涡旋振荡仪(江苏康健医疗用品有限公司)；恒温水浴锅(上海精宏实验设备公司)。透析专用鲎试剂检测试剂盒(0.25 EU/ml，Lot No 130725，Lot No 140825)、透析专用鲎试剂检测试剂盒(0.5 EU/ml，Lot No 120916，Lot No 140705)、透析专用鲎试剂检测试剂盒(2 EU/ml，Lot No 130620，Lot No 140825，Lot No 151201)和动态浊度法鲎试剂盒(Lot No 180627B)均来源于厦门鲎试剂生物科技股份有限公司。细菌内毒素工作标准品，无热原吸头，细菌内毒素检查用水，无热原板条，无热原接收管。

2.3 透析相关细菌内毒素限值

(1)根据国家医药行业标准《血液透析及治疗相关用水》(YY 0572-2015):透析用水的内毒素含量应≤0.25 EU/ml[10]。美国医疗仪器促进协会(The Association for the Advancement of Medical Instrumentation，AAMI)采用2EU/ml的水平作为内毒素的上限值[11]。欧洲药品质量管理局(European Directorate for the Quality of Medicines &HealthCare，EDQM)规定0.25 EU/ml为内毒素的上限值。国际标准化组织(ISO)在ISO13959:2009标准2008年的修订过程中，0.25 EU/ml的限值被列入作为透析用水内毒素的上限值。

(2)根据国家医药行业标准《血液透析及相关治疗用浓缩物》(YY 0598-2015):浓缩物以细菌内毒素用水配制成透析液后，透析浓缩液的内毒素限量应＜0.5 EU/ml[12]。

(3)根据原国家卫生和计划生育委员会2010版《血液净化标准操作规程》，透析液内毒素限量＜2 EU/ml[13]。

2.4 凝胶法检测内毒素(透析专用鲎试剂)

(1)阴性对照溶液的制备。即细菌内毒素检查用水(TAL reagent water，TRW)。

(2)阳性对照溶液的制备。浓度为2λ的内毒素溶液(λ为鲎试剂的标示灵敏度)。

(3)样本溶液的制备。用无热原采样瓶收集适量的透析用水或透析液。按鲎试剂的灵敏度(λ)及样本的内毒素限值(L)计算样品的最大有效稀释倍数(maximum allowable dilution，MVD)，其计算为公式1:

(4)样本阳性对照溶液的制备。含2λ内毒素的样本溶液或稀释后样本溶液。

(5)实验操作。从试剂盒内取出8支鲎试剂，开启，设置检查项目及加样见表1。

表1 设置检查项目及加样(ml/管)

加样完毕，封闭管口，轻轻摇匀混合液，放入37 ℃的恒温水浴锅温育60 min，温育期间避免振动。

(6)结果判断。将安瓿从恒温水浴锅中轻轻取出，缓慢倒转180°。若安瓿内的内容物呈坚实凝胶，不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为(+)；不呈凝胶或虽生成凝胶但不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为(-)。

(7)当阴性对照管结果均为阴性，阳性对照管和样品阳性对照管为阳性，实验有效，否则无效，应重复实验。

2.5 动态浊度法检测内毒素

(1)程序设置。①仪器预热，设置孵育温度为37 ℃；②振板设定为中速，振板5 s；③动力学参数设定，读板120 min，读板间隔30 s，检测波长为630 nm。

国际关系史的经验证明，文化差异是影响国家间深入合作的隐形沟壑，是导致国家间信任缺失的重要因素之一。“文化间良性的交流与合作可以增进各国间友好关系的发展”，“不同文化间的良性互动关系不仅有利于文化发展，而且有利于国家间关系趋稳、趋善。”[5]因此，加强中国与中亚国家之间的互信与合作，必须要跨越文化差异的障碍。文化的传播、交流与互动是促成文化间开展对话、达成文化和解与包容的重要途径。

(2)标准曲线制备。将细菌内毒素工作标准品制备成5个浓度的稀释液，相邻浓度间稀释倍数≤10倍，最低浓度不低于所用鲎试剂的标准检测限。取细菌内毒素工作标准品1支，加入1.0 ml细菌内毒素检查用水，涡旋振荡15 min，将其稀释配制成0.005 EU/ml、0.01 EU/ml、0.1 EU/ml、1 EU/ml和10 EU/ml的5种浓度的反应溶液，阴性对照为细菌内毒素检查用水。每个浓度点测3个平行，阴性对照测两个平行。

(3)标准曲线及样品检测。取每个浓度点的内毒素溶液各0.1 ml或样品0.1 ml与0.1 ml鲎试剂反应。鲎试剂的准备:用移液器准确吸取细菌内毒素检查用水1.7 ml，沿瓶壁加入西林瓶内，轻轻转动瓶壁，使内容物全部溶解(避免产生气泡)。

(4)数据处理。设定启动OD(一般设定为0.02)，软件自动给出启动时间。建立标准曲线为公式2:

式中y为启动时间的对数值，x为内毒素浓度的对数值，a为直线斜率，b为y轴截距。

当阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间，标准曲线的相关系数｜r｜≥0.980，标准曲线成立。

3 结果

3.1 透析专用鲎试剂(凝胶法)检测

2014-2017年采用3种规格透析专用内毒素凝胶法检测试剂盒检测结果见表2。

表2 透析用水、透析浓缩液及透析液内毒素检测结果

3.2 动态浊度法检测

内毒素浓度标准曲线中Y=-0.2593X+2.938 r=0.997，见图1。

图1 内毒素浓度标准曲线图

表3 供试液样品的内毒素浓度检测值

采用定量检测法—动态浊度法检测试剂盒结合专业设备Elx808IULALXH检测反渗水、透析液、置换液以及反渗水出(回)水口的内毒素浓度值见表3。

表3结果表明，出口反渗水和反渗水回水口的内毒素值偏高，应立即进行消毒。

4 讨论

临床透析单位内毒素检测普遍采用凝胶法，虽然此法操作简单，结果一目了然。但也存在一些不足:①无法掌控合格值下的趋势变化，试剂精密度较差，灵敏度误差为0.5～2；②凝胶法鲎试剂根据凝胶的形成情况，用肉眼判断阴阳性，容易造成假阳性、假阴性的判断结果，对技术水平要求高。

临床上有时需要对内毒素的浓度进行实时监测，凝胶法无法精准定量，应当选择动态浊度法。近年来，大中型透析中心逐渐开始应用定量分析方法检测透析用水、透析浓缩液和透析液的内毒素浓度。动态浊度法与凝胶法的反应原理相同，是根据鲎试剂在形成凝胶的过程中反应液浑浊度上升的速度和反应液中内毒素浓度成比例的原理所设计的定量法鲎试剂，灵敏度高达0.005 EU/ml，检测范围宽，可根据样本的限值和微生物的生长曲线及样本监测趋势定出检测样本的预警区间。

37 ℃为鲎试验最优条件，但实验对温度非常敏感，所以设备温控的精准度是实验结果准确的重要条件[14]。定量检测法—动态浊度法所需仪器为带温育系统的动力学光度测定仪器及配套软件，如全进口的ELx808IULALXH为各大国内外公司常用及推荐的内毒素定量检测设备，带有4-Zone温控专利。设备要能符合ISO15189认证，抗干扰能力强，温控精度高，光路系统精确度、灵敏度稳定；实现批量微量化微板检测、自动化检测；符合药品生产质量管理规范(good manufacturing practice，GMP)及美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)要求，保障准确的实验结果。

内毒素检测由医院检验中心及院外有资质的第三方检验机构执行，实际操作时有许多因素会影响内毒素检测结果。对于透析浓缩液早期出现过阳性不合格结果，从影响内毒素检测结果的相关风险环节查找风险因素及原因发现，浓缩液B液搅拌桶以及B液成品桶微生物指标超标，针对性采取提高消毒频次，采用多种消毒手段相结合的措施，抑制微生物生长达到有效控制内毒素的质量控制目的。

临床上有些数据提示，在使用透析液时需要对其进行实时监测。经过透析治疗的患者，其内毒素水平并不能马上降低，甚至短时间内会有所上升[15-6]。具体表现:①患者治疗第1 d的内毒素含量为0.95 EU/ml，与正常人相比其数值具有显著差异(正常人内毒素含量为0.13±0.07 EU/ml)；②治疗第3 d，内毒素含量上升至1.63 EU/ml，直到治疗第7 d，内毒素含量降至0.65 EU/ml，与未经治疗的患者相比，数值具有显著差异，未经治疗的患者内毒素含量在第7 d为1.03 EU/ml；③透析液的贮存时间也会影响血透效果，甚至季节变化到温度较为适中的月份都会加快革兰氏阴性菌的生长繁殖[17-18]。因此，血透室要注意配液时间、配液浓度及保存时间等质量进行控制，这主要是因为透析使用的透析液是在室温下保存，且多次使用于血液透析，透析过程经常未加盖，透析液处于开放状态，盛放透析液的器皿未经消毒处理，上述因素使得透析液受到污染，细菌大量繁殖。

5 结论

动态浊度法测试的结果明确显示出透析系统某些环节内毒素的动态变化，如反渗水管路入口和出口，以及回路的内毒素数值的变化，从而制定相应的解决方案，指导临床透析的环节质量控制，以提高透析系统的安全性。临床透析工程学质量控制需按下述要求进行。

(1)经常对反渗透机、供水管路及透析机进行联动消毒。根据表3的结果，反渗水、出口反渗水、入口反渗水以及反渗水出(回)水口的内毒素检测均超标，表明应当提高检测频次，而有利于预测内毒素的预警区间。消毒时使消毒液充满系统每个部分，并保持必要的时间，以达到良好的消毒效果。具有热消毒功能的反渗透机、供液管路及透析机，建议至少每周进行1次联动热消毒。

(2)在透析机上加装超净滤器(内毒素滤器)，能阻止透析系统中细菌和内毒素的通过，从而有效地降低细菌及内毒素对透析系统的污染，是一种十分有效的方法。目前各大医院有不同国内外品牌透析机，工艺参差不齐，导致内毒素污染风险加大，建议提高透析机与出水口连接装置内毒素检测频次。

(3)自行配制透析液单位，采用人工、机械搅拌等方式，透析液B浓缩液现用现配，不使用剩余浓缩液。建议使用无菌B浓缩液或联机B干粉。复用的B液成品桶应每日使用反渗水冲洗、倒置，周期性消毒和更换。

(4)集中配供浓缩液系统的配液间应安装空调及通风设施和洗手盆，同时应安装空气杀菌装置抑制细菌滋生；配液、供液系统相关容器、管道消毒抑菌控毒应遵从设备生产商的维护要求实施[19]。

患者进行血液透析时，如果透析用水和透析液被微生物污染，则会导致多种并发症，甚至直接威胁到患者的生命。一旦水解后的内毒素穿过透析膜进入患者体内，便会产生热源性反应，进而引发低血压、发热、肌肉痉挛等症状，严重时直接导致休克。因此，进行血液透析系统内毒素检测与控制是必不可少的重要环节。