肺结核病原体和易感因素及结核分枝杆菌优势耐药谱分析

吴亦斐，赵 刚，陈淑丹2，张学潮，李清春，陆 敏，程庆林，严 杰3，谢 立

结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)感染引起的结核病是全球流行的常见传染病，严重危害人类健康[1]，耐药尤其耐多药或广泛耐药结核分枝杆菌感染所致的结核病一直是该病防控工作中的重点和难点[2]。我国是结核病高负担国家之一，结核病患者约占全球病例总数的25%[3]，近年来我国进行了多次全国性结核分枝杆菌耐药状况检测，浙江地区也不例外，结果均显示该菌耐药性依然严重且耐药菌株流行[4-6]。尽管结核分枝杆菌可感染各种组织和器官并引起疾病，但以肺结核最为常见[7-8]。相对于大中城市而言，县镇人群卫生条件和医疗水平较差，了解这些地区结核病流行现状、病原体种类及其耐药情况，对于结核病防控具有重要意义。本研究对杭州市周边7个县镇3 552例临床诊断为肺结核患者标本进行了分枝杆菌分离鉴定和结核分枝杆菌药物敏感试验，分析了这些地区结核分枝杆菌流行现状、耐药性与优势耐药组合模式以及性别、年龄、职业和户籍对肺结核患病率的影响，为制定更为有效的结核病防控策略提供依据。

1 材料与方法

1.1临床标本来源 2013年1月至2016年12月杭州市周边7个县镇3 552例临床诊断为肺结核患者抗酸染色阳性痰涂片分枝杆菌培养物由各县镇结核病定点医院提供。病例分类：①初治：未接受抗结核药物治疗或抗结核药物治疗1个月以内；②复治：接受抗结核药物治疗一个月以上[9-10]。上述3 552例患者中，2 840例为初治患者、712例为复治患者，男性2 526例、女性1 026例，年龄范围10～94岁。

1.2分枝杆菌分离培养 上述分枝杆菌培养物标本接种于酸性改良罗氏培养基，按结核病实验室检验规程分离培养分枝杆菌[11]。酸性改良罗氏培养基购自杭州市创新生物技术有限公司。

1.3结核分枝杆菌鉴定 按结核病实验室检验规程，采用对硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)选择与鉴别培养法对上述分枝杆菌阳性培养物进行分枝杆菌菌种鉴定[11]。TCH培养基上生长但PNB培养基上不生长的菌株判为人型结核分枝杆菌(Mycobacteria tuberculosis)，PNB和TCH培养基上均不生长的菌株判为牛型结核分枝杆菌(Mycobacteria bovis)，均属于结核分支杆菌复合群(mycobacterium tuberculosis complex，MTBC)，简称为结核分枝杆菌。两种培养基上均生长的菌株判为非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)。PNB和TCH培养基购自珠海贝索生物技术有限公司。

1.4药物敏感试验 按结核病诊断实验室检验规程，采用间接比例法检测结核分枝杆菌菌株对异烟肼(INH)、链霉素(SM)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)、卡那霉素(KM)和氧氟沙星(OFX)的敏感性[11]。灭菌接种环取一环各结核分枝杆菌菌株对数生长期培养物，无菌磨砂管碾磨后用灭菌磷酸缓冲盐水(PBS)配制成1.0麦氏浓度菌液，然后用PBS稀释成10-2和10-4CFU/mL菌液。取0.01 mL不同稀释浓度菌液均匀密集划线接种于含药或无药培养基上，37 ℃培养4～8周，同一稀释浓度含药培养基上的菌落数生长菌落数与无药培养基上生长的菌落数比较>1%判为耐药。INH耐药临界浓度为0.2 μg/mL、SM耐药临界浓度为4.0 μg/mL、RFP耐药临界浓度为40 μg/mL、EMB耐药临界浓度为2.0 μg/mL、KM耐药临界浓度为30 μg/mL、OFX耐药临界浓度为4.0 μg/mL。INH、SM、RFP和EMB购自杭州市创新生物技术有限公司，OFX和KM购自珠海贝索生物技术有限公司。实验中采用结核分枝杆菌参考标准株H37RV为对照。

1.5结核分枝杆菌耐药类型分析 INH、SM、RFP、EMB为临床一线抗结核药物，KM和OFX为二线抗结核药物[11-13]。结核分枝杆菌耐药类型如下：①总耐药：对1种或1种以上抗结核药物耐药；②单耐药：仅对1种抗结核药物耐药；③一线药物耐药：对1种或1种以上一线抗结核药物耐药；④耐多药：对INH和RFP耐药，也包括同时对其他一线抗结核药物耐药； ⑤多耐药：对1种或1种以上一线抗结核药物耐药，但不包括同时对INH和RFP耐药；⑥广泛耐药：同时对INH和RFP耐药外，还对1种氟喹诺酮类抗生素和1种其他二线抗结核药物耐药[12-13]。

1.6肺结核患病率影响因素分析 确诊为肺结核患者(有肺结核临床表现并检出结核分枝杆菌)性别、年龄、职业和不同人群来源进行分析，以了解上述因素对肺结核患病率的影响。

1.7统计学分析 采用SPSS19.0软件中χ2检验对不同药物耐药率以及各种肺结核患病影响因素进行统计学分析，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1分枝杆菌菌种鉴定结果 3 552例分枝杆菌阳性培养物中，88.7%(3 152/3 552)鉴定为结核分枝杆菌，11.3%(400/3 552)鉴定为非结核分枝杆菌(表1)。3 152株结核分枝杆菌中，82.8%(2 609/3 152)来自初治患者，17.2%(543/3 152)来自复治患者。400株非结核分枝杆菌中，57.8%(231/400)菌株来自初治患者，42.2%(169/400)菌株来自复治患者，复治患者感染非结核分枝杆菌比例(23.7%，169/712)显著高于初治患者(8.1%，231/2 840)(χ2=138.67,P<0.05)。

2.2结核分枝杆菌耐药率和耐药组合模式 3 152株结核分枝杆菌中，74.9%(2 362/3 152)菌株对各受试药物敏感，25.1%(790/3 152)菌株至少对一种抗结核药物耐药，6种抗结核药物中SM(χ2=50.40，P<0.05)和INH(χ2=47.81，P<0.05)耐药率较高，然后依次为RFP、OFX、EMB和KM，来自初治患者结核分枝杆菌对不同抗结核药物耐药率排序与之相同，来自复治患者结核分枝杆菌对INH耐药率最高、其次为SM，其他抗结核药物耐药率排序相同，但来自复治患者结核分枝杆菌对各抗结核药物的单药耐药率显著高于初治患者(表1)。790株耐药结核分枝杆菌中，有35种耐药谱(耐药种类和组合模式)；对单个抗结核药物的耐药率以SM最高、其次是INH，但来自复治患者结核分枝杆菌对单个药物的耐药率以INH最高、其次是SM；2、3和4种抗结核药物优势耐药组合模式分别是INH+SM(9.2%)(χ2=19.20，P<0.05)、INH+RFP+SM(5.7%)(χ2=24.85，P<0.05)和IHN+RFP+SM+EMB(4.3%)(χ2=20.11，P<0.05)(表2)。

表1 3 152株结核分枝菌株对不同抗结核药物的耐药率
Tab.1 Resistance ratios of 3 152M.tuberculosisisolates against different anti-tuberculosis drugs

药物初治病例菌株(n=2 609)复治病例菌株(n=543)总菌株(n=3 152)χ2P耐药株数耐药率(%)耐药株数耐药率(%)耐药株数耐药率(%)SM29711.410719.740412.827.85<0.05INH2549.714526.739912.7117.04<0.05RFP1375.39717.92347.4104.03<0.05OFX983.8427.71404.416.76<0.05EMB562.2407.4963.141.48<0.05KM170.791.7260.85.560.036

表2 790株耐药结核分枝杆菌菌株的耐药谱
Tab.2 Profile of 790 drug resistantM.tuberculosisisolates

耐药谱初治耐药菌株(n=582)复治耐药菌株(n=208)总耐药菌株(n=790)株数构成比(%)株数构成比(%)株数构成比(%)SM16027.52512.018523.4INH11018.93416.414418.2OFX7512.9115.38610.9RFP559.5178.2729.1EMB111.900111.4KM30.510.540.5合计41471.48842.350263.5INH+SM528.92110.1739.2INH+RFP122.1188.7303.8INH+OFX40.752.491.1INH+EMB40.720.960.8INH+KM10.20010.1SM+OFX50.920.970.9SM+EMB30.510.540.5SM+KM20.30020.3RFP+SM91.620.9111.4RFP+EMB10.210.520.3RFP+OFX10.210.520.3合计9416.25325.514718.6INH+RFP+SM264.5199.1455.7INH+SM+EMB71.220.991.1INH+SM+OFX20.341.960.8INH+SM+KM30.510.540.5INH+RFP+OFX30.552.481.0INH+RFP+EMB10.231.440.5INH+RFP+KM10.20010.1SM+EMB+OFX10.210.520.3SM+EMB+KM10.210.520.3RFP+SM+KM10.20010.1合计467.93617.38210.4IHN+RFP+SM+EMB172.9178.2344.3IHN+RFP+SM+OFX10.210.520.3IHN+RFP+SM+KM0010.510.1IHN+RFP+EMB+OFX30.531.460.8IHN+SM+EMB+KM10.20010.1IHN+RFP+SM+EMB+OFX20.341.960.8IHN+RFP+SM+EMB+KM30.50030.4IHN+RFP+SM+EMB+OFX+KM10.252.460.8合计284.83114.9597.5

2.3结核分枝杆菌耐药类型 3 152株结核分枝杆菌中，25.1%(790/3 152)至少对一种药物耐药(总耐药)，15.9%(502/3 152)、22.2%(700/3 152)、4.6%(146/3 152)、3.9%(122/3 152)和0.2%(6/3 152)分别为单耐药、一线抗结核药物耐药、耐多药、多耐药和广泛耐药(表3)。初治和复治患者结核分枝杆菌单耐药率无显著性差异(χ2=0.04，P>0.05)，但复治患者结核分枝杆菌总耐药、一线药物耐药、耐多药、多耐药和广泛耐药率均显著高于初治患者(表3)。

表3 结核分枝杆菌耐药类型及其分布
Tab.3 Drug resistance types and their distribution inM.tuberculosisisolates

菌种初治病例菌株(n=2 609)复治病例菌株(n=543)总菌株(n=3 152)χ2P耐药株数耐药率(%)耐药株数耐药率(%)耐药株数耐药率(%)总耐药58222.320838.379025.161.14<0.05单耐药41415.98816.250215.90.04>0.05一线药物耐药50419.319636.170022.273.24<0.05耐多药702.77614.01464.6130.23<0.05多耐药863.3366.61223.913.42<0.05广泛耐药10.0450.960.218.42<0.05

2.4肺结核患病率影响因素 3 152例检出结核分枝杆菌的肺结核患者中，男性(71.6%，2 256/3 152)显著多于女性(28.4%，896/3 152)(χ2=1173.60，P<0.05)；>60年龄组肺结核患病率(39.3%，1 240/3 152)显著高于41～60年龄组(27.6%，870/3 152)(χ2=94.97，P<0.05)、21～40年龄组(27.8%，875/3152)(χ2=97.52，P<0.05)和≤20(5.3%，167/3 152)年龄组(χ2=1053.39，P<0.05)，41～60和21～40年龄组肺结核患病率差异无统计学意义(χ2=0.02，P>0.05)，但均高于≤20年龄组(χ2=570.41，P<0.05)；农民肺结核患病率显著高于其他职业(χ2=1500.34，P<0.05)；本地户籍肺结核患病率显著高于外地户籍(χ2=1435.29，P<0.05)(表4)。

表4 肺结核患病率影响因素分析
Tab.4 Drug resistance types and their distribution inM.tuberculosisisolates

影响因素初治病例(n=2609)复治病例(n=543)总病例(n=3152)例数构成比(%)例数构成比(%)例数构成比(%)性别 男性1 81069.444682.12 25671.6 女性79930.69717.989628.4年龄 0～201576.2101.81675.3 21～4077729.89818.187527.8 41～6068826.418233.587027.6 >6098737.825346.61 24039.3职业 农民1 55759.737068.11 92761.1 企事商业职工38214.65610.343813.9 民工29511.3519.434611.0 教师/学生1184.5001183.7 离退人员1756.7478.72227.1 其他职业823.2193.51013.2户籍 本地1 89872.743079.22 32873.9 外地71127.311320.882426.1

3 讨 论

结核病曾肆虐全球绝大多数国家和地区，广泛接种结核疫苗和抗结核药物问世后，结核病疫情一度受到控制，但近年来结核病又开始广泛流行，成为最常见的再发传染病(re-emerging disease)[14]。2017年WHO报道，全球每年新增结核病患者约960万，其中耐多药结核病患者48万[15]，我国每年新增耐多药结核病患者也高达12万左右[12]。结核病再次广泛流行的因素复杂多样，其中结核分枝杆菌不断增强的耐药性是首要因素[16-18]。一般而言，大中城市人群卫生知识和条件对比县镇地区人群较好且医疗水平较高。因此，县镇地区人群结核病发病率以及结核分枝杆菌耐药性监测是各国疾病预防控制中心的重要任务，进而了解结核病和结核分枝杆菌耐药菌株流行总体现状，同时为更有效地防控和诊治结核病提供依据[19]。

非结核分枝杆菌指除结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌总称，感染后可引起NTM肺病。本研究对2013-2016年杭州周边7个县镇3 552例临床诊断为肺结核患者临床标本的病原体检测结果显示，3 152例为结核分枝杆菌、400例为NTM。值得关注的是，复治患者NTM感染率为23.7%，初治患者仅为8.1%，两者感染率之间存在统计学差异(P<0.05)。有文献报道，除结核分枝杆菌外，近年来NTM感染率也不断上升，此类分枝杆菌对各种抗结核药物常呈高耐药性，呼吸道也是其常见感染和致病部位[20-23]。结核病通常是慢性消耗性疾病，患者通常抗感染免疫力低下或受损，抗结核药物治疗中易感染高耐药性NTM[24]。上述资料提示，肺结核患者抗结核药物治疗过程中，特别注意高耐药性非结核分枝杆菌再感染。

INH、SM、RFP、EMB为临床常用一线抗结核药物[11-13]。我们的药物敏感试验结果显示，初治或复治患者中分离的结核分枝杆菌对SM和INH耐药率(12.8%和12.7%)显著高于RFP和EMB(7.4%和3.1%)(P<0.05)，与近年浙江省和杭州市区耐药调查结果一致[6, 25]。值得关注的是，来自复治病例的结核分枝杆菌对各一线抗结核药物耐药率均显著高于初治患者(P<0.05)。上述资料提示，可能由于一线抗结核药物中INH和SM使用频率较高，结核分枝杆菌更易产生耐药性，但不规范使用抗结核药物往往是促进结核分枝杆菌产生耐药性的重要因素，值得基层临床医师特别注意。

为了提高治疗效果和减少耐药性产生，结核病治疗中通常联合用药[19]。本研究结果分析显示，790株耐药结核分枝杆菌中有高达35种耐药谱(耐药种类和组合模式)，2、3和4种抗结核药物优势耐药组合模式分别是INH+SM、INH+RFP+SM和IHN+RFP+SM+EMB(P<0.05)。上述资料提示，结核分枝杆菌菌株对不同抗结核药物耐药性差异较大，不同结核病患者治疗前后反复进行药物敏感试验极为必要，以选择更佳药物组合获得更好疗效，结核分枝杆菌菌株已对SM和INH有较高耐药率，治疗前更应根据药物敏感试验结果选择用药。

根据临床上常用抗结核药物种类及其联合用药方案，可将结核分枝杆菌耐药类型分为总耐药、单耐药、一线药物耐药、耐多药、多耐药和广泛耐药[12-13]。我们的药物敏感试验结果显示：结核分枝杆菌总耐药、耐多药和广泛耐药率分别为25.1%、4.6%和0.2%，初治或复治患者结核分枝杆菌总耐药率分别为22.3%和38.3%。根据最近2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告，结核分枝杆菌总耐药率为42.1%、耐多药率为6.8%、广泛耐药2.1%，但初治患者结核分枝杆菌总耐药率为42.7%、复治患者为38.5%[5]。安徽省2014年初治和复治患者结核分枝杆菌总耐药率分别为15.9%和52.9%，2008和2000年浙江省初治和复治患者结核分枝杆菌总耐药率分别为26.6%和50.0%、18.6%和68.5%[26-27]。上述资料表明，2013-2016年杭州郊县(区)初治和复治患者结核分枝杆菌总耐药、耐多药和广泛耐药率均低于全国平均水平，复治患者结核分枝杆菌总耐药率低于本省2000年和2008年以及安徽省2014年水平，初治患者结核分枝杆菌总耐药率虽低于本省2008年平均水平，但高于本省2000年和安徽省2014年水平，提示本地区耐药结核分枝杆菌流行和传播情况仍然较为严重。

除病原体外，结核病罹患和流行的影响因素众多，营养和卫生状况是结核病危险因素[1, 17-18]。我们的分析结果显示，3 152例肺结核患者中，男性患者多于女性、年龄越大患病率越高、农民肺结核患病率高于其他职业(P<0.05)。令人意外的是，上述患者中本地户籍者肺结核患病率显著高于外地户籍(P<0.05)。外地户籍者大多为来杭基层打工的青壮年，以往认为该人群生活和卫生条件相对较差，除年龄偏低外，其肺结核患病率较低可能与近年杭州周边县镇经济和卫生环境有明显改善有关。中国已进入老龄化社会，60岁以上人口比例持续增大，老年人群肺结核患病率较高可能与机体免疫力下降以及打牌等室内小群体活动多、户外活动少等习惯有关。因此，县镇地区本地户籍老年男性农民可能成为肺结核易感人群，值得继续调查和关注。