不同提取方法对烟草纤维素微观结构的影响

杨莫愁，周 顺，张晓宇，杨 俊，王孝峰，田振峰，葛少林，王婉婉，刘 非，徐迎波*，孔 俊，何 庆

1.中国科学技术大学烟草与健康研究中心，合肥市徽州大道1129号 230052

2.安徽中烟工业有限责任公司烟草行业燃烧热解研究重点实验室，合肥市高新区天达路9号 230088

3.安徽中烟工业有限责任公司烟草化学安徽省重点实验室，合肥市高新区天达路9号 230088

纤维素是烟草细胞壁的主要成分，是构成烟叶细胞组织和骨架的基本物质，其燃烧行为对烟草整体的燃烧行为有重要影响［1-3］。近年来，纤维素作为烟草中重要大分子物质之一，受到研究人员的广泛关注。朱晓兰等［4］采用糖、酸介质处理烟草纤维素，发现纤维素的形态结构发生变化，可及度增大。杨滢等［5］研究发现，烟草纤维素结构上的差异使其表现出不同的燃烧热解特性，导致烟草纤维素热解产物的质量分数产生明显差异。纤维素的微观结构主要指晶区和非晶区的结构，是决定纤维素性质的重要因素［6-9］。纤维素的性质非常复杂，会随植物来源、分离和提纯过程以及聚集状态的变化而产生较大差异［10］。天然烟草纤维主要包含纤维素、半纤维素、木质素、果胶及脂肪、淀粉、蛋白质等成分。关于烟草纤维素的微观结构研究，在对烟草纤维素微观结构影响尽量小的前提下进行纤维素提取具有非常重要的现实意义。目前，烟草纤维素分离和提纯过程对其微观结构的影响研究鲜见报道。固体交叉极化/魔角旋转13C核磁共振（CP/MAS13C NMR）技术是研究高分子化合物化学结构和物理性质的重要工具之一，基于该技术，研究人员不需要对固体粉末组分进行分离和溶解等处理，可通过定量估计其化学组成和化学结构直接获得可靠的结构信息。因此，结合烟草行业标准方法 YC/T 347—2010［11］及植物纤维素提取中广泛采用的方法［12］，本研究中采用中性洗涤剂法［11］、酸性洗涤剂法［11］、酸性水解法［13-14］、碱液分离法［15-16］对烤烟和香料烟烟叶样品中的纤维素进行提取，利用CP/MAS13C NMR技术对4种提取方法所获纤维素样品的微观结构进行对比分析，探究不同提取方法对烟草纤维素微观结构的影响，旨在为烟草纤维素的提取及微观结构的研究提供方法参考，并为进一步揭示烟草纤维素微观结构对其燃烧热解机制的影响奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

烟叶样品由安徽中烟工业有限责任公司提供，包括烤烟（2017年，贵州正安，C3F）和香料烟（2016年，云南保山，B二级）。烟叶样品于烘箱中（40±1）℃干燥2 h，机械粉碎，过425 μm（40目）筛，密封储存备用。

苯、乙醇、乙醚、丙酮、乙二胺四乙酸二钠、四硼酸钠、十二烷基硫酸钠、乙二醇乙醚、磷酸氢二钠、冰醋酸、盐酸、正辛醇、氢氧化钠、浓硫酸、亚氯酸钠（AR，国药集团化学试剂有限公司）；耐高温α-淀粉酶（BR）、十六烷基三甲基溴化铵、亚氯酸钠（AR）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；水为二次蒸馏水。

AVANCE AV 400超导傅里叶数字化核磁共振谱仪（德国Bruker公司）；HHS11-2型恒温水浴锅（上海科升仪器公司）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；YB-2000A型高速多功能粉碎机（永康市速锋工贸有限公司）；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱（上海右一仪器公司）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州市长城仪器公司）；SL234型电子天平（感量0.000 1 g，美国Denver公司）；SZ-93A自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 烟草纤维素提取

1.2.1.1 试样脱脂

参考文献［11］方法进行烟草样品的脱脂处理。称取20 g试样，置于1 000 mL圆底烧瓶中，依次加入苯、乙醇各200 mL和乙醚40 mL；将圆底烧瓶置于水浴锅中加热，开启冷凝水，维持微沸状态4 h。取烧杯和经过与试样相同脱脂处理并用丙酮冲洗后的滤纸，置于烘箱中烘干至恒质量，放入干燥器中备用。水浴锅停止加热后，将烧瓶静置冷却，抽滤，并用丙酮冲洗至滤出液无色。将滤纸和滤渣一起转移到烧杯中，放入烘箱中在（105±2）℃条件下烘干至恒质量，置于干燥器中备用。

1.2.1.2 中性洗涤剂法提取

采用烟草行业标准 YC/T 347—2010［11］中的中性洗涤方案对烤烟和香料烟烟叶样品中的纤维素进行初步提取，获得中性洗涤纤维样品。参考文献［17-18］的方法对样品进行纯化：

称取27 g NaOH，量取75 mL冰醋酸，将二者混合并用蒸馏水稀释至1 L，得到醋酸缓冲溶液。将抽干后的烟草中性洗涤纤维样品置于圆底烧瓶中，加入200 mL 1.7%（质量分数）NaClO2溶液，在pH=4.5（加入200 mL醋酸缓冲溶液）、油浴125℃条件下加热4 h。加热结束后，抽滤，用蒸馏水清洗3次。将脱除木质素后的样品置于圆底烧瓶中，在室温下加入400 mL 2.5 mol/L的HCl溶液，采用油浴加热至100℃，保持4 h。加热结束后，抽滤，并用热水（90～100℃）冲洗管壁和剩余物。抽干后将剩余物放入（105±2）℃烘箱中烘干至恒质量。

1.2.1.3 酸性洗涤剂法提取

采用烟草行业标准 YC/T 347—2010［11］中的酸性洗涤方案对烤烟和香料烟烟叶样品中的纤维素进行提取，获得酸性洗涤纤维素样品。

1.2.1.4 酸性水解法提取

参考文献［13-14］的方法对烟草样品中的纤维素进行酸性水解法提取。称取5.0 g脱脂样品，置于圆底烧瓶中，加入100 mL蒸馏水和2.2 mL浓硫酸，在90℃下搅拌2 h，以水解半纤维素。加热结束后，抽滤，用蒸馏水清洗3次。将样品转移至圆底烧瓶中，加入200 mL 1.7%（质量分数）NaClO2溶液，在pH=4.5、油浴125℃条件下加热4 h。加热结束后，抽滤，用蒸馏水清洗3次，将剩余物放入（105±2）℃烘箱中烘干至恒质量。

1.2.1.5 碱液分离法提取

采用文献［15-16］的方法对烟草样品中的纤维素进行碱液分离法提取。称取5.0 g脱脂样品，置于圆底烧瓶中，加入100 mL 4%NaOH溶液，在油浴125℃下加热2 h。加热结束后，抽滤，用蒸馏水清洗3次。将剩余物转移至圆底烧瓶中，加入200 mL 1.7%（质量分数）NaClO2溶液，在pH=4.5、油浴125℃条件下加热4 h。加热结束后，抽滤，用蒸馏水清洗3次，将剩余物放入（105±2）℃烘箱中烘干至恒质量。

1.2.2 烟草纤维素纯度和得率测定

采用 Van Soest法［19］测定中性洗涤剂法、酸性洗涤剂法、酸性水解法、碱液分离法提取所得纤维素纯度。称取0.5 g纤维素样品（m0），加入100 mL酸性洗涤剂，煮沸并回流1 h。抽滤，用沸水浸泡15～20s后冲洗过滤。加入少量丙酮洗涤残渣，用蒸馏水反复冲洗至洗涤液中性，将残渣烘干至恒质量m1（g）。向所得酸性洗涤纤维素中加入25 mL 72%硫酸，搅拌条件下消化3 h，过滤，洗涤至中性，烘干至恒质量m2（g）。

纤维素纯度（P）计算如式（1）：

纤维素得率（Y）计算如式（2）：

式中：M为烟叶样品质量（g）。

1.2.3 烟草纤维素微观结构表征

利用CP/MAS13C NMR技术对烟草纤维素样品微观结构进行分析，测试条件：场强9.4 T，4 mm魔角探头，转速15 kHz，脉冲宽度90°，交叉极化时间4 µs，接触时间2 ms，采样时间34 ms，采样间隔时间2.0 s，扫描次数1 024次，谱宽300（10-6），一级定标溶剂（CH3）4Si。运用MestReNova 6.1.1软件及Peakfit 4.0软件处理实验所得光谱，采用波谱去卷积技术对图谱进行分峰处理，通过峰形拟合计算烟草纤维素样品晶型及分布、结晶度、原纤尺寸等结构信息［20］。

2 结果与讨论

2.1 烟草纤维素的得率及纯度

采用中性洗涤剂法、酸性洗涤剂法、酸性水解法、碱液分离法提取烤烟和香料烟烟叶样品的纤维素，纤维素纯度与得率见表1。可以看出，采用酸性水解法提取所得的烤烟烟叶纤维素的得率最高，为12.1%，与文献［21］报道的烤烟烟叶纤维素含量分布具有一致性。采用4种提取方法获得的烤烟烟叶纤维素样品的纯度大小顺序为：中性洗涤剂法（81.2%）＞酸性水解法（78.6%）＞碱液分离法（74.4%）＞酸性洗涤剂法（53.1%）。香料烟烟叶纤维素的得率和纯度结果与烤烟烟叶一致。

就中性洗涤剂法而言，烟叶经中性洗涤剂处理后得到中性洗涤纤维，采用NaClO2和HCl溶液分别脱除中性洗涤纤维中的木质素和半纤维素，即获得纤维素样品。采用该方法所得纤维素样品中纤维素的纯度较高，但是为了去除残留的洗涤剂，需要多次洗涤样品，因此纤维素得率较低。

对于酸性洗涤剂法来说，烟叶样品经过酸性洗涤剂处理，蛋白质、糖类、脂类及部分半纤维素被脱除，但仍存在木质素及少量半纤维素杂质，因此采用该方法所得纤维素样品的纯度最低。由于该方法亦需多次洗涤样品以去除残留的洗涤剂，因此纤维素得率较低。

碱液分离法是基于NaOH溶液可以削弱纤维素和半纤维素之间的氢键及半纤维素和其他组分内部分子之间酯键的皂化作用［22］，使木质素和半纤维素溶于NaOH溶液的一种纤维素提取方法。烟叶经NaOH溶液处理后再用NaClO2溶液脱除其中残留的木质素即可获得纤维素样品。由于纤维素提取过程中部分纤维素会与NaOH溶液反应而消解［23］，因此碱液分离法的得率较低。

酸性水解法采用稀硫酸溶液处理烟叶样品，在稀酸溶液中，木质素可降解为多种单环芳香族化合物，半纤维素也可降解为多糖或醛酸，但纤维素不会发生溶解。在利用NaClO2溶液脱除木质素后，即可实现纤维素和木质素、半纤维素的分离。此外，酸性溶液能够增大纤维素的可及度［22］，因此酸性水解法的纤维素得率最高。采用该方法所得纤维素的纯度居于中性洗涤剂法与碱液分离法之间。

表1 4种提取方法所获烟草纤维素的纯度和得率Tab.1 Purity and yield of tobacco cellulose obtained by four extraction methods

2.2 烟草纤维素的CP/MAS13C NMR光谱

采用中性洗涤剂法、酸性洗涤剂法、酸性水解法和碱液分离法等4种方法提取所得烤烟和香料烟烟叶纤维素样品，并对其进行CP/MAS13C NMR分析，结果如图1和表2所示。可以看出，烟草纤维素的13C NMR吸收信号峰主要在δ60～110之间。其中，δ95～110处的吸收峰归属于C-1，表征晶态结构，通过对其拟合可得到纤维素晶型及比例；δ80～90处的吸收峰归属于C-4，表征纤维素的结晶区和无定形区，常用于研究纤维素结晶区内和无定形区内纤维素分子的排列情况，通过拟合及计算可获得结晶度和原纤尺寸等结构信息；δ60～68和68～80处的吸收峰分别归属于C-6和吡喃环上的其他C（C-2,3,5）。

图1 烟草纤维素样品的CP/MAS13C NMR光谱图Fig.1 CP/MAS13C NMR spectra of tobacco cellulose samples

表2 烟草纤维素样品CP/MAS13C NMR光谱的化学位移Tab.2 CP/MAS13C NMR chemical shifts for tobacco cellulose samples

2.3 烟草纤维素的晶型及分布

纤维素在固态下存在着5种结晶变体，天然纤维素的结晶格子被称为纤维素I。纤维素I是纤维素 Iα和纤维素 Iβ两种晶体的混合物［24］，二者比例随着原料种类及处理方式的不同而变化。在一定条件下，纤维素I可以转化为次晶或无定形纤维素［8,25］。

图2 中性洗涤剂法烤烟纤维素样品的CP/MAS13C NMR光谱C-1信号峰拟合结果Fig.2 Fitting result of C-1 signal peak of13C CP/MAS NMR spectra of flue-cured tobacco cellulose extracted by neutral detergent method

根据 Larsson等提出的概念［26-27］，利用 4个Lorentzian线形表示不同的晶型，并利用Peakfit 4.0软件对C-1信号峰进行拟合。图2为采用中性洗涤剂法提取所得的烤烟烟叶纤维素样品的核磁共振光谱C-1信号峰拟合结果。纤维素Iα在δ104.8处显示1个单一的共振峰；纤维素Iβ显示1个双峰（δ105.4和δ103.5处）；δ104.2处的单一信号峰归属于次晶，其表示有序性不及但运动性大于纤维素 Iα和 Iβ的结晶结构。

根据不同纤维素样品C-1信号峰拟合峰的相对信号强度计算纤维素样品的晶型比例，结果如表3所示。由表3可知，烤烟和香料烟烟叶纤维素样品均以纤维素Iβ晶型为主，并且不同方法获得的烟草纤维素的晶型分布存在明显差异。采用中性洗涤剂法和酸性洗涤剂法提取所得的纤维素样品均具有较高相对含量的纤维素Iβ晶体，且中性洗涤剂法＞酸性洗涤剂法；采用酸性水解法和碱液分离法提取所得的纤维素Iβ晶体相对含量均较低，且二者无显著差异。对于酸性水解法，酸溶液的加入促使样品发生溶胀，导致介质溶液到达纤维素结晶区，进而对结晶表面造成了一定的破坏［4］，使得纤维素Iβ晶体的相对含量减少。在碱液分离法提取过程中，由于纤维素上的羟基是极性基团，因此碱液是纤维素的良好润胀剂［28］。碱液中的OH-与纤维素作用时可渗透到纤维内部，破坏纤维素结晶区表面，导致纤维素Iβ晶体的相对含量降低。

进一步分析可知，烟草纤维素样品中次晶晶体相对含量的大小顺序为：碱液分离法＞酸性水解法＞酸性洗涤剂法＞中性洗涤剂法，说明采用碱液分离法、酸性水解法和酸性洗涤剂法提取烟草纤维素，能够促使纤维素内部少量结晶体发生从有序到无序的转变。与酸性水解法和碱液分离法相比，酸性洗涤剂法对纤维素的晶型及分布的影响较小，这主要归因于该法采用的酸溶液浓度较低。综上可知，中性洗涤剂法对烟草纤维素晶型分布的影响最小。

表3 4种方法所得烟草纤维素样品的晶型分布Tab.3 Crystal distribution of tobacco cellulose obtained by four extraction methods

2.4 烟草纤维素的结晶度及原纤结构

利用Peakfit 4.0软件对CP/MAS13C NMR光谱C-4信号峰进行分析，图3为采用中性洗涤剂法提取所得的烤烟烟叶纤维素样品的C-4信号峰拟合结果。在有序的C-4区域（δ86～92）采用Lorentzian线形对纤维素 Iα、纤维素 Iα+β、纤维素 Iβ的信号进行拟合；在无序的C-4区域（δ80～86）采用 Gaussian线形对次晶纤维素（PC）、可及基原纤表面（AS）和不可及基原纤表面（IAS）的信号进行拟合。由此分析纤维素不同结晶结构所占比例，并由AS和IAS的相对信号强度计算横向基原纤尺寸及基原纤聚集束尺寸［29］。表4显示了不同提取方法所得烟草纤维素样品的CP/MAS13C NMR光谱C-4信号峰拟合得到的结晶度及原纤结构信息。

图3 中性洗涤剂法烤烟纤维素样品的CP/MAS13C NMR光谱C-4信号峰拟合结果Fig.3 Fitting result of C-4 signal peak of13C CP/MAS NMR spectra of flue-cured tobacco cellulose extracted by neutral detergent method

表4显示，采用中性洗涤剂法提取所得烟草烤烟烟叶纤维素样品的结晶度最高，为43.8%，与文献［20］结果一致。采用酸性洗涤剂法、酸性水解法和碱液分离法提取所得纤维素样品的结晶度明显低于采用中性洗涤剂法提取所得的纤维素。与中性洗涤剂法相比，酸性洗涤剂法提取所得烟叶纤维素样品的结晶纤维素含量略有降低，但次晶纤维素含量显著降低。半纤维素作为纤维素聚集态和三级结构的调节剂，与纤维素有紧密缔合作用。采用酸性洗涤剂法提取所得的纤维素样品中存在半纤维素杂质，可使纤维素分子间的聚集态减弱，进而导致部分次晶纤维素转化为无定形状态的纤维素［30］。

进一步分析可知，采用酸性水解法和碱液分离法提取所得的烟叶纤维素样品中结晶纤维素含量明显降低。原因是：酸处理使烟草纤维中木质素及半纤维素发生降解，增大了纤维素的可及度，对纤维素的结晶结构造成了一定的破坏［31］，进而导致结晶纤维素含量下降。而NaOH溶液能够溶胀纤维素，破坏木质素、半纤维素对纤维素的包裹作用，使纤维素结晶区受到破坏［32］，进而导致结晶度下降。综上可知，与酸性洗涤剂法、酸性水解法和碱液分离法相比，中性洗涤剂法对烟草纤维素的结晶度影响最小。

植物纤维细胞壁中的纤维素分子链平行排列形成基原纤，若干根基原纤组成微原纤，微原纤平行地组合在一起形成原纤。有文献报道［30］，纤维素结构水平上的变化会影响纤维素在化学改性中的活性、纤维素被酶水解的易感性和纤维的强度性能等。由表4可知，纤维素基原纤聚集束尺寸大小顺序为：中性洗涤剂法＞酸性水解法＞酸性洗涤剂法＞碱液分离法。4种提取方法中，采用中性洗涤剂法获得的烟草纤维素纯度最高，半纤维素及木质素对基原纤、微原纤的束缚作用减弱，而且对纤维素链结构的影响最小，因此采用该方法提取所得的纤维素样品的基原纤尺寸和基原纤聚集束尺寸均大于其他3种方法。可及基原纤表面是纤维素中能够提供羟基与带支链的化合物发生化学反应的部分［33］，在纤维素提取过程中，脱除半纤维素和木质素，可及基原纤表面和基原纤聚集束的尺寸均会有所增加。对于由基原纤聚集形成基原纤聚集束的结构，基原纤聚集束尺寸越小，可及基原纤的表面越大，纤维素羟基的反应性和可及度也越高［32］。因此，不同纤维素提取方法会对烟草纤维素原纤结构产生显著影响。相较于酸性洗涤剂法、酸性水解法和碱液分离法，中性洗涤剂法对烟草纤维素的原纤结构影响最小。

表4 烟草纤维素样品C-4信号峰拟合的定量信息Tab.4 Quantification results from spectral fitting of tobacco cellulose C-4 signal peak

3 结论

①采用中性洗涤剂法、酸性洗涤剂法、酸性水解法和碱液分离法提取烟叶样品中的纤维素，其中中性洗涤剂法提取所得烟草纤维素纯度最高。②4种方法提取所得烟草纤维素的晶型相同，均以纤维素Iβ晶型为主，但分布存在明显差异。中性洗涤剂法对烟草纤维素的晶型分布影响最小，酸性洗涤剂法、酸性水解法和碱液分离法能够促使纤维素内部少量结晶体发生从有序到无序的转变。中性洗涤剂法获得烤烟烟叶纤维素样品的结晶度最高（43.8%），基原纤尺寸（3.4 nm）及基原纤聚集束尺寸（8.9 nm）最大。与其他3种方法相比，中性洗涤剂法对烟草纤维素结晶度和原纤结构的影响最小。③不同提取方法对烟草纤维素的微观结构有显著影响。对比其他3种方法，中性洗涤剂法对纤维素微观结构影响小，提取所得烟草纤维素纯度高，因此适合作为烟草纤维素结构研究中纤维素的提取方法。