丙硫氧嘧啶联合丹栀复方治疗甲状腺功能亢进合并妊娠小鼠对其子代甲状腺功能的影响

包春燕， 周林裕， 于晓霞， 李彩霞

（西安交通大学医学院附属3201医院，陕西汉中 723000）

甲状腺功能亢进（以下简称“甲亢”）是临床上较为常见的一种疾病，发病率较高。其病因主要是由于机体甲状腺激素分泌过多，引起机体自身代谢升高。甲亢为特异性自身免疫性疾病，女性发病率更高[1-3]。甲亢是妊娠期女性常患的疾病，会对子代造成不良影响，如出现新生儿体质量偏小、甲状腺功能异常，甚至会出现早产、流产、死胎、畸形等情况。甲亢临床表现有高代谢症候、眼突出、弥漫性甲状腺肿等。目前尚无研究确切地阐述其发病机理，其治疗主要依靠抗甲状腺药物治疗和手术治疗[4]。抗甲状腺药物的作用可逆，不损害甲状腺滤泡结构，也不造成永久性甲状腺功能减退。丙硫氧嘧啶（propylthiouracil，PTU）作为一种常见的抗甲状腺药物，通过减少血液中T4向T3的转化，有效控制母体的甲状腺激素含量，达到治疗效果[5]，但其对胎儿的影响尚缺乏相关的研究和结论。另外，大量临床研究表明，中医药复方制剂可有效缓解甲亢患者的临床症状。为探究PTU及联合中药制剂（选择自拟丹栀复方）治疗甲亢后对胎儿的影响，本研究以小鼠为研究对象，观察其疗效及对子代小鼠甲状腺功能的调节作用，以期为临床治疗提供依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级C57/BL6雌性小鼠150只，体质量（19.11±1.36）g，鼠龄8周；SPF级C57/BL6雄性小鼠50只，体质量（20.14±1.55）g，鼠龄8周。均由湖北省疾病控制中心提供，生产许可证号：SCXK（鄂）2015-0018。养殖环境温度为（25.0±1.0）℃，湿度为70%～85%。所有小鼠状态良好，精神状态稳定，无撕咬、争斗、攻击行为。本研究中动物实验经西安交通大学医学院动物伦理委员会同意，所有操作符合标准。

1.2 药物与制备 丹栀复方组成：牡丹皮15 g，栀子12 g，柴胡12 g，苍术12 g，地骨皮12 g，白芍10 g，当归10 g，白术10 g，生姜5 g，甘草6 g，柏子仁15 g，薄荷8 g，麦冬15 g，钩藤12 g，酸枣仁16 g。各中药材均购自西安交通大学医学院附属3201医院药房。将上述中药材加500 mL蒸馏水，文火煎煮，取汁150 mL，备用[6]。按照人与动物间体表面积等效表[7]换算出小鼠丹栀复方剂量为11.0 g·kg-1·d-1（设定人的体质量为70 kg，体表面积单位质量用药量的折算系数为9.1）。丙硫氧嘧啶片购自西安交通大学医学院附属3201医院药房。

1.3 试剂与仪器 Ad-TSHR289/6xHis腺病毒，购自上海吉玛生物公司（中国），由公司定制，无产品型号；总三碘甲状腺原氨酸（TT3）、总甲状腺素（TT4）、游离三碘甲状腺原氨酸（free triiodothyronine，FT3）、游离甲状腺素（free thyroxine，FT4）测定试剂盒购自南京建成生物公司（中国），序号分别为H224、H225、H222、H223；60 000 cpm 的125I-反三碘甲状腺原氨酸（rT3），60 000 cpm的125I-T4，160 000 cpm的125I-T3，质量浓度为10 μg/mL的T3标准品2 mL，浓度为10 μg/mL的T4标准品2 mL，质量浓度为10 μg/mL的rT3标准品2 mL均购于北京北方生物技术研究所（中国），定制产品，无产品型号。Multiskan酶标仪（美国Thermo Scientific公司）；Aquaplore 3超级纯水仪（美国艾科浦国际有限公司）；BSA423S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；5424R离心机（德国Eppendorf公司）。

1.4 造模 实验小鼠适应7 d后，随机抽取120只雌性小鼠进行造模处理，剩下30只雌性小鼠设为正常组。于小鼠腿部注射腺病毒Ad-TSHR289/6xHis（滴度为1×1010颗粒/50 μL）免疫建立甲亢模型，每3周免疫1次，总共免疫3次。判断甲亢模型造模成功的标准为：FT4和FT3水平显著増高，甲状腺组织有弥漫性甲状腺肿伴或不伴促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）降低[6]。故检测各组小鼠造模前后的FT4、FT3水平，以判断造模成功与否。

1.5 分组与给药 将造模成功的雌性小鼠分为4组：空白组，模型组，PTU组，PTU+丹栀复方组。各组分别与正常同龄雄性小鼠按雌雄比2∶1合笼配对，经过2次合笼，每次合笼时间为2 d，剔除11只未受孕的雌性小鼠。发现雌鼠阴道栓则视为妊娠第1天，继续饲养并分别给PTU组、PTU+丹栀复方组灌胃PTU悬浊液4.0 mg·kg-1·d-1、丹栀复方11.0 g·kg-1·d-1+PTU 4.0 mg·kg-1·d-1。从受孕成功开始持续给药16 d，观察直至分娩，分娩后母乳喂养，获得分娩后3周的母鼠和子鼠。模型组、空白组小鼠灌胃等量生理盐水，采用同样的方法和饲养环境获得母鼠和子鼠。观察子鼠的基本情况，统计不良妊娠发生率（=不良妊娠/总亲本数）。流产、早产、死胎等非正常分娩行为则被判定为不良妊娠发生。雄性小鼠在配对前血清中FT3和FT4平均水平分别为（5.18±1.03）fg/mL和（18.86±5.14）fg/mL。

1.6 酶联免疫吸附分析（ELISA）检测小鼠甲状腺激素水平 小鼠分娩后，于3周龄时空腹24 h，腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg体质量）麻醉小鼠。摘眼球采集血液，抗凝静置2 h后，以3 000 r/min的速度离心15 min。取上清液，采用ELISA法检测甲状腺激素 TT3、TT4、FT3、FT4的水平。根据 TT3、TT4、FT3、FT4试剂盒说明书稀释浓度梯度标准品，绘制标准曲线。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品40 μL，然后再加生物素标记的抗体10 μL。将样品加于酶标板孔底部。每孔加入酶标试剂50 μL，空白孔不加。封板室温静置30 min。将浓缩洗涤液用蒸馏水后备用。去封板膜，弃液体，每孔以上述洗涤液重复洗涤5次，加入显色液，37℃避光显色10 min，加终止液50 μL，终止反应。用酶标仪读取吸光度后，根据标准曲线计算TT3、TT4、FT3、FT4的质量浓度。

1.7 采用放射免疫法测量脱碘酶的活性 取小鼠肝脏，加入1 mL缓冲液（0.01 mol/L的PBS，1 mmol/LDTT，2mmol/LEDTA，pH=7），4℃10000 r/min速度离心20 min，取上清液用Bradford蛋白测定法定量蛋白含量；分别以125I-rT3、125I-T4、125I-T3为底物，根据免疫反应，测定上清液中的Ⅰ型脱碘酶（ID1）、Ⅱ型脱碘酶（ID2）、Ⅲ型脱碘酶（ID3）的活性。

1.8 统计方法 应用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(-x±s)表示，多组比较采用多因素方差分析法，2组比较采用t检验，百分比数据采用卡方检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模前后雌性亲本小鼠FT3、FT4水平比较 表1结果显示：造模前，造模组小鼠甲状腺激素FT3、FT4水平与正常组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；造模后，造模组小鼠FT3、FT4水平均较造模前升高，且显著高于正常组（P＜0.05）。表明造模成功。

2.2 各组母鼠不良妊娠发生率、子鼠体质量比较 表2结果显示：空白组无不良妊娠发生。模型组发生8例不良妊娠，不良妊娠发生率为33.33%。与空白组比较，模型组母鼠不良妊娠发生率升高，子鼠体质量降低（均P＜0.05）；与模型组比较，PTU组和PTU+丹桅复方组母鼠不良妊娠发生率降低，子鼠体质量升高（均P＜0.05），且PTU+丹桅复方组对其改善作用优于PTU组。

表1 造模前后雌性亲本小鼠FT3、FT4水平比较Table 1 Comparison of the levels of FT3and FT4 in the of female parent mice before and after modeling[-x±s，ρ/（fg·mL-1）]

表2 各组母鼠不良妊娠发生率、子鼠体质量比较Table 2 Comparison of the rate of abnormal pregnancy in female mice and the body mass of offspring mice in various groups

2.3 各组子鼠甲状腺激素水平比较 表3结果显示：与空白组比较，模型组子鼠血清TT3、TT4、FT3、FT4含量均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，PTU组和PTU+丹栀复方组子鼠的TT3、TT4、FT3、FT4水平均显著降低（P ＜ 0.05），且PTU+丹栀复方组对子鼠TT3、TT4、FT3、FT4水平的降低作用优于PTU组（P＜0.05）。

2.4 各组子鼠脱碘酶活性比较 表4结果结果显示：与空白组比较，模型组子鼠ID1、ID2水平均显著升高，ID3水平显著降低（均P＜0.05）；与模型组比较，PTU组和PTU+丹栀复方组子鼠ID1、ID2水平均显著降低，ID3水平显著升高（均P＜0.05），且PTU+丹栀复方组对子鼠ID1、ID2、ID3的改善作用优于PTU组（P＜0.05）。

表3 各组子鼠血清TT3、TT4、FT3、FT4含量比较Table 3 Comparison of the serum contents of TT3，TT4，FT3and FT4 in the offspring mice in various groups (-x±s)

表4 各组子鼠脱碘酶活性比较（-x±s）Table 4 Comparison of the activity of deiodinases in the offspring mice in various groups[（pmoL125I/mg protein-1·min-1）

3 讨论

甲状腺是机体最重要的腺体之一，妊娠期的大量生理活动都和甲状腺激素的调控息息相关。甲状腺激素有三碘甲状腺原氨酸（T3）和甲状腺素（T4）2种主要形式，机体中的甲状腺激素多以T4的形式贮存，而T3量虽然较少，生物活性却比T4强得多[8]。当机体缺少甲状腺激素时，体内贮存的T4则通过脱碘酶的作用将T4转化为活性更强的T3。T4可以经过ID1和ID2的外环脱碘，形成T3，或者由ID1或者ID3的内环脱碘后，转化成不具有生物活性的反3，3’，5’-三碘甲状腺原氨酸（rT3），最终由ID1或ID2多次催化脱碘，形成不含碘的物质，代谢出机体外。ID1是唯一一种既可以催化内环脱碘，又可以外环脱碘的酶，是机体中催化T4向T3转化的主要脱碘酶，这种途径也是机体保证T3含量的主要来源[9-11]。机体内甲状腺激素水平和脱碘酶的含量指示了甲状腺功能的状态。3种脱碘酶在机体中共同调整甲状腺激素的相互转化，保持机体的甲状腺激素水平平衡。PTU治疗甲亢的主要机制是通过阻止T4向T3转化，实现减弱具有生物活性的甲状腺激素含量[4]。

在本研究中，妊娠小鼠采用PTU联合丹栀复方治疗，可纠正甲状腺功能过于活跃的现象，显著降低妊娠小鼠的甲状腺激素水平，且子代小鼠发育正常。同时，PTU+丹栀复方组的子代小鼠ID1、ID2含量显著降低，ID3活性显著升高。提示PTU联合丹栀复方治疗妊娠小鼠，不仅降低妊娠小鼠的甲状腺激素水平，而且加速甲状腺激素的代谢，保持正常的甲状腺激素水平，并显著降低了不良妊娠的发生率。但其药理还需要进一步研究。综上所述，PTU联合丹栀复方治疗妊娠合并甲亢的小鼠有显著效果，对子代小鼠的甲状腺激素水平有重要调节作用，使子代小鼠甲状腺水平趋于正常水平，显著降低子代的不良妊娠发生率。