膝三脏汤不同工艺提取物对KOA模型大鼠血清炎症因子及软骨端粒酶活性的影响

邢振龙， 戚子荣， 丘青中

（广东省中西医结合医院，广东广州 528200）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是以膝关节软骨及周围肌肉、滑膜、韧带或其他结构慢性无菌性炎症为主要表现，伴随关节间隙变窄、关节边缘及胫骨髁间隆突骨赘形成的病症[1]。其中医病机以肝肾亏虚为主，筋骨肌肉失养所致。膝乃筋骨肉之大会，由肝、肾、脾三经所系，肝藏血、主筋，肾藏精、主骨生髓，脾主运化、合肉，故治疗当从“肝—脾—肾”三脏一体整体观念出发，以三脏同治、先后天同治为法，从而达到滋补肝肾、强筋壮骨、益气健脾、通络止痛之效。膝三脏汤是岭南名医丘青中教授30多年临床经验的结晶，为经验方，疗效好[2-4]。本课题组前期研究表明，膝三脏汤复方粗液可抑制大鼠KOA模型的炎症因子释放[5]，但粗液成分复杂，难以进一步深入研究，因此，本研究将膝三脏汤粗液用不同工艺进行提取纯化，将提取物再次作用于大鼠KOA模型并比较其药效，以期明确膝三脏汤的主要药效部位，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 SPF级健康Wistar大鼠70只，体质量（250±10）g，雌雄各半，由佛山大学体育运动实验中心代购。实验动物合格证号：SCXK（粤）2013-0034。按照随机数字表将70只大鼠分为7组，即空白组、模型组、美洛昔康组、膝三脏汤—石油醚组、膝三脏汤—氯仿组、膝三脏汤—乙酸乙酯组、膝三脏汤—正丁醇组，每组10只。经统计学处理，7组动物在实验前其性别、体质量均无统计学差异（P＞0.05）。

1.2 药物、试剂与仪器 膝三脏汤中药组成：熟地黄20 g、吴茱萸8 g、党参10 g、山药15 g、茯苓20 g、白术15 g、续断15 g、黄芪20 g、牛膝10 g、杜仲15 g、当归15 g、骨碎补15 g、补骨脂15 g、甘草10 g。上述中药材由广东省中西医结合医院中药房提供。美洛昔康片，规格为每片7.5 mg，由扬子江药业生产，批号为8090941。白细胞介素（IL）-1、IL-6，肿瘤坏死因子（TNF）-α酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；TRAPeze ELISA端粒酶检测试剂盒（德国Boehringer-mannheim公司）；水合氯酸（天津科密欧化学试剂公司）；注射用青霉素钠（哈药集团）；硫酸庆大霉素注射液（河南天方药业）。Sunrise酶标仪（瑞士Tecan公司）；慕丝线（强生公司）。

1.3 药物制备 ①膝三脏汤不同工艺提取物制备方法：将按膝三脏汤处方比例的中药材置入超声仪中，加10倍量水浸泡1 h后，煎煮1 h，滤出煎液。滤渣加入8倍量水煎煮1 h，合并煎液。再以1∶8的比例加入体积分数70%乙醇溶液，盖上盖子，浸泡20 min。然后开启超声仪30 min，弃去药渣，得到提取液，将其置入分液漏斗并加入200 mL蒸馏水制成混悬液，然后依次用等体积的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，每组重复3次，依次得到相应提取物。②美洛昔康混悬液：每片溶于25 mL生理盐水中，制备成0.3 mg/mL的混悬液。

1.4 造模 实验动物喂养1周适应新环境后，采用改良Hulth法[6]行右膝造模。术前备皮、禁食禁水，给予大鼠腹腔注射10%水合氯醛（剂量为0.35 mL/100 g）麻醉。将大鼠仰卧固定，络合碘消毒、铺巾，取右膝内侧缘纵行切口，极度屈曲、外翻膝关节，暴露关节间隙后依次切断前交叉切带、去除内侧半月板、保留软骨面，冲洗后给予8万U的硫酸庆大霉素关节腔内注射，后逐层缝合切口。患肢不包扎、不固定。术后青霉素肌肉注射抗炎3 d。术后碘伏消毒7 d，早晚各1次。16周后，KOA大鼠模型造模成功[6]。

1.5 给药 造模成功后，膝三脏汤—石油醚组、膝三脏汤—氯仿组、膝三脏汤—乙酸乙酯组、膝三脏汤—正丁醇组分别给予膝三脏汤石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物（剂量均为10 mL/kg）灌胃。美洛昔康组给予美洛昔康混悬液（剂量为3 mg/kg）灌胃。空白组、模型组给予等体积蒸馏水灌胃。每天2次，给药6周后进行取样检测。

1.6 指标检测与方法

1.6.1 取材 ①取血：腹主动脉取血，在室温下静置1 h。待血液凝固以3 000 r/min 4℃离心10 min。将血清移至EP管中，于4℃冰箱中保存待测。②膝关节软骨：取大鼠双膝胫骨平台软骨，一侧软骨用福尔马林溶液固定48 h后送检，另一侧软骨利用分析天平称湿质量。鼓风加热机以60℃加热关节软骨，12 h后取出，采用同一天平称取干质量。

1.6.2 采用双抗体夹心ELLSΑ法测定血清中IL-1、IL-6、TNF-α含量 具体操作步骤按IL-1、IL-6、TNF-α ELLSΑ试剂盒说明书进行。

1.6.3 软骨含水率测定 取双侧股骨髁软骨。按以下公式计算：软骨含水率=[（软骨湿质量-软骨干质量）/软骨湿质量]×100%。

1.6.4 采用TRAPeze-ELISA法检测软骨端粒酶活性 给药结束后24、48、72 h采用TRAPeze-ELISA法分别检测端粒酶活性。按照参考文献[7-9]所述方法进行端粒酶组织提取液的制备及测定，具体步骤按照试剂盒说明书进行操作。用双波长酶标仪测定反应液450 nm处的吸光度（D）值（对照波长为690 nm），以二者之差ΔD[D（450 nm）-D（690 nm）]来判断端粒酶阳性[9]：ΔD＜0.2为阴性，ΔD≥0.2为阳性。以试剂盒所自带的标准Hela细胞株提取物作为阳性对照，以阳性标本95℃灭活10 min的标本作为阴性对照。

1.7 统计方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(-x±s)表示，多组比较采用单因素方差分析。进一步两两比较，若满足正态性、方差齐性，用LSD法检验；若满足正态性，不满足方差齐性，则采用Dunnett T3检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膝三脏汤不同提取物对KOA大鼠炎症因子含量的影响 表1结果显示：模型组大鼠血清炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α含量较空白组明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，各膝三脏汤提取物组、美洛昔康组大鼠血清炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α含量均降低，其中：乙酸乙酯组IL-1、TNF-α含量明显低于氯仿组、正丁醇组（P＜0.05），与石油醚组、美洛昔康组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；乙酸乙酯组IL-6含量低于石油醚组、正丁醇组（P＜0.05），与氯仿组、美洛昔康组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。提示膝三脏汤石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物可改善KOA大鼠炎症水平，且膝三脏汤—乙酸乙酯组的降低程度较为明显。

表1 膝三脏汤不同提取物对KOA模型大鼠炎症因子的影响Table 1The effect of different KTD extracts on serum inflammatory cytokines in KOA rats[-x±s，ρ/（pg·mL-1）]

2.2 膝三脏汤不同提取物对KOA模型大鼠关节软骨含水率的影响 表2结果显示：模型组大鼠关节软骨含水率较空白组升高（P＜0.05）。与模型组比较，各膝三脏汤提取物组、美洛昔康组大鼠关节软骨含水率均明显降低，其中：乙酸乙酯组大鼠关节软骨含水率低于石油醚组、正丁醇组（P＜0.05），与氯仿组、美洛昔康组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。提示膝三脏汤石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物可改善KOA模型大鼠关节软骨组织成分，且膝三脏汤—乙酸乙酯组的降低程度较为明显。

表2 膝三脏汤不同提取物对KOA模型大鼠关节软骨含水率的影响Table 2 The effect of different KTD extracts on the moisture content in articular cartilage in KOA rats(-x±s)

2.3 膝三脏汤不同提取物对KOA模型大鼠软骨端粒酶活性的影响 表3结果显示：模型组大鼠软骨端粒酶活性较空白组升高（P＜0.05）。与模型组比较，各膝三脏汤提取物组、美洛昔康组大鼠软骨端粒酶活性均明显降低，其中：乙酸乙酯组大鼠软骨端粒酶活性均低于氯仿组、正丁醇组（P＜0.05），与石油醚组、美洛昔康组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。提示膝三脏汤石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物可改善KOA模型大鼠软骨老化情况，且膝三脏汤—乙酸乙酯组的降低程度较为明显。

3 讨论

因复方汤液是多种有效成分及无效成分组合的集合体，故本研究在既往膝三脏汤复方汤剂（粗液）研究的基础上，采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯及正丁醇4种溶剂对膝三脏汤的有效成分进行提取，观察其对KOA模型大鼠模型的作用效果，初步分析和评价膝三脏汤不同工艺提取物的功能活性和潜力。

表3 膝三脏汤不同提取物对KOA模型大鼠软骨端粒酶活性的影响Table 3 The effect of different KTD extracts on cartilaginous telomerase activity in KOA rats (-x±s)

KOA为膝关节的一种无菌性炎症。IL-1、IL-6、TNF-α是参与KOA的重要致炎性细胞因子，由单核巨噬细胞系统产生。软骨细胞表面由于有高水平IL-1受体的存在，致使软骨胶原表型改变，使之更易被基质金属蛋白酶（MMPs）消化[10-12]，表明IL-1可加快软骨细胞凋亡。IL-6在骨关节炎的全层软骨及滑膜中呈现过量表达[13]，提示1L-6与骨关节炎的发生有一定的关系。IL-6还通过自分泌形式作用于软骨细胞，进而影响软骨细胞正常增殖[14]。TNF-α在KOA的进展中起关键作用，它不仅能破坏关节软骨、降解软骨基质，还促进炎症进一步发展。有研究表明，TNF-α对骨质及关节软骨破坏的主要原因是通过增加MMP的表达及活性[15，16]，进而增强炎性细胞的破坏力[17]，TNF-α还能诱导软骨细胞向成纤维细胞样细胞转化，使滑膜组织发生纤维性病变，促进滑液中细胞因子异常升高，增加骨和软骨的破坏[18]。本研究结果显示，膝三脏汤石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物均可降低KOA模型大鼠炎症因子IL-1、IL-6及TNF-α含量，表明其对膝骨性关节的局部炎症因子释放均有抑制作用；但是不同工艺提取物的作用程度不同，数据显示，乙酸乙酯提取物对炎症因子的降低程度较其他提取物更为明显。

端粒是位于真核细胞的染色体末端的DNA重复序列，它对染色体具有保护作用，是调控因子中的重要成分，与细胞周期调控因子相互作用可导致细胞老化[19]。多数情况下，常因端粒酶的活性降低，端粒在复制分裂过程中逐渐失去碱基对，致使端粒逐渐缩短，细胞发生老化、凋亡[20]。KOA软骨细胞的凋亡与细胞的端粒长度、端粒酶活性密切相关。本研究结果显示，膝三脏汤石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物对端粒酶活性均有明显的抑制作用，但乙酸乙酯提取物抑制端粒酶活性的作用程度较其他提取物更为明显。

综上所述，膝三脏汤乙酸乙酯提取物可明显抑制KOA大鼠模型血清炎症因子IL-1、IL-6及TNF-α的释放，并可降低关节软骨的含水率，对端粒酶的活性有一定的调控作用。本研究结果提示：在同一生药量前提下，膝三脏汤被乙酸乙酯溶剂提取出来的主要药效成分的部分生物活性作用较膝三脏汤石油醚、氯仿、正丁醇提取物强。但其提取物的毒理作用及具体成分、结构尚不清楚，有待下一步进行深入研究以分析确定。