肺炎克雷伯菌质粒介导喹诺酮类耐药基因的研究*

孙元振 张志军 亓 然

1.济南市第二妇幼保健院检验科，山东 济南 271100； 2.泰安市中心医院检验科，山东 泰安 271000

肺炎克雷伯菌是医院内感染的常见病原菌之一，2017年全国细菌耐药报告显示肺炎克雷伯菌的分离率占全部革兰阴性杆菌的20.2%，分离数量位居所有分离菌的第二位。同时，肺炎克雷伯菌对三代头孢菌素的全国平均耐药率为33.0%。近年来[1]，随着喹诺酮类抗菌药物的广泛应用治疗，临床分离肺炎克雷伯菌对喹诺酮类抗生素的耐药性逐年升高。有研究发现由质粒介导的基因qnr在喹诺酮类耐药方面发挥了重要作用[2-4]。为寻找其耐药原因，本研究对济南市第二妇幼保健院2018年1月至2018年6月临床分离的26株产超广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌中质粒介导喹诺酮耐药基因的流行情况进行了分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 菌株来源

收集2018年1月至2018年6月济南市第二妇幼保健院临床分离出的26株产超广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌，标本分别来自痰液、脓液、血液、咽拭子等。

1.2 方法

1.2.1细菌鉴定及药敏试验

采用Walk Away 96 PLUS NC61复合板鉴定菌种及进行药敏试验，用纸片扩散法复核qnr阳性菌株对环丙沙星、左氧氟沙星、阿米卡星、庆大霉素、头孢西丁、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、亚胺培南和美罗培南抗菌药物的敏感性。并根据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)2017年版要求进行抗菌药物敏感性判读[5]。

1.2.2耐药基因检测

采用PCR法：用煮沸法提取制备DNA模板，引物和反应程序参照文献[6]。扩增产物在含2%溴化乙锭的琼脂糖凝胶中进行DNA电泳，用凝胶成像系统观察结果。

DNA测序：随机取部分阳性基因进行测序，PCR产物送上海桑尼生物科技有限公司进行测序，结果进行BLAST序列比对分析。

2 结 果

2.1 抗菌药物敏感实验结果

21株含qnr基因的肺炎克雷伯菌，对头孢唑林、头孢噻肟和头孢吡肟的耐药率均为100.0%(21/21)，对头孢西丁和头孢他啶的耐药率分别为14.3%(3/21)和47.6%(10/21)，对阿米卡星和庆大霉素的耐药率分别为4.8%(1/21)和52.4%(11/21)，对环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率分别为52.4%(11/21)和38.1%(8/21),对亚胺培南和美罗培南全部敏感。21株含qnr基因的肺炎克雷伯菌对11种抗生素的敏感情况见表1。

表1 21株含qnr基因的肺炎克雷伯菌对11种抗生素的敏感情况

2.2 喹诺酮类耐药基因qnr及测序结果

26株肺炎克雷伯菌中，共21株(80.8%)检测出qnr基因，其中1株(3.9%)qnrA基因阳性(图1A)，7株(26.9%)qnrB基因阳性(图1B)，15株(57.7%)qnrS基因阳性(图1C)；3株(11.5%)qnrB和qnrS同时阳性。 取qnrA阳性基因PCR扩增产物进行测序，结果为qnrA。随机取3株qnrB阳性基因PCR扩增产物进行测序，结果为qnrB。随机取3株qnrS阳性基因PCR扩增产物进行测序，结果为qnrS。

3 讨 论

近年来，本院细菌耐药结果显示，肺炎克雷伯菌的分离率一直位居前列。肺炎克雷伯菌已成为本院院内感染的常见病原菌之一。随着肺炎克雷伯菌对头孢菌素类抗菌药物的多重耐药，喹诺酮类抗菌药物成为临床常用的抗生素之一，因此我院近年来临床的分离的肺炎克雷伯菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药率逐年上升。

图1 qnr耐药基因PCR产物电泳图

通常认为肺炎克雷伯菌对喹诺酮类耐药机制主要是天然耐药，即病原菌对抗生素的耐药机制主要为染色体介导，不会发生耐药基因的转移。近年来，研究发现除了天然耐药之外，还有获得性耐药，即同种或不同种细菌之间可以发生基因的水平传播，通过耐药基因载体如质粒、整合子、转座子等介导，引起细菌耐药性的广泛、迅速传播，导致多药耐药。耐药基因载体的参与是临床多药耐药形成的重要原因，其中qnr基因就是临床耐药基因载体质粒携带的常见耐药基因。美国学者发现qnr在产ESBLs菌株中检出率高，qnr与ESBLs有着很强的关联性[2，7-9]。因此本研究选取我院2018年1月至2018年6月临床分离的26株产ESBLs的肺炎克雷伯菌对其qnr基因进行报道研究。

研究发现，我院26株肺炎克雷伯菌中qnr的阳性率高达80.8%(21/26)，其中qnrS基因型的表达率最高，占57.7%(15/26)，其次为qnrB基因型，阳性率为26.9%(7/26)，只有一株菌株表达qnrA基因型，阳性率占3.9%(1/26)。与其它地区相比我院临床分离的产ESBLs的肺炎克雷伯菌qnr基因携带率较高，2011年姜梅杰等[6]报道的泰安地区耐头孢噻肟的肺炎克雷伯菌中qnr阳性率为43.9%。而Robicsek A等研究发现，耐头孢他啶的肺炎克雷伯菌中qnr的阳性率仅为20%[10]。出现上述耐药基因的差异可能是由于各地区抗菌药物的使用不同导致。因此在以后的临床工作中，我们需从思想上重视肺炎克雷伯菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药性问题，加强喹诺酮类药物使用的规范化和合理化,合理使用抗生素，检测细菌耐药情况，切断传播途径，防止耐药菌的交叉感染。