去甲万古霉素血药浓度检测方法的建立及评价

董 迪，毛 璐，宋 菲，张 威，甄健存（北京积水潭医院，北京 100035）

去甲万古霉素是我国研制生产的糖肽类抗生素，其化学结构、药理性质和抗菌作用与万古霉素相似，但治疗成本明显低于万古霉素。由于万古霉素与去甲万古霉素对耐药金黄色葡萄糖球菌和表皮葡萄球菌感染有很好的疗效，且不易诱导细菌产生耐药性，因此深受临床重视，实际应用中常需监测血药浓度。测定万古霉素血药浓度的方法主要为高效液相色谱法和免疫法。采用高效液相色谱法检测去甲万古霉素血药浓度灵敏度高、专一性好，但样本处理方法复杂且测量速度慢，不符合医院监测血药浓度的实际情况，而目前市场上没有专门针对去甲万古霉素开发的检测试剂盒。因此研究一种适用于医疗机构的去甲万古霉素血药浓度的方法十分必要。我院目前使用的血药浓度检测仪器为德国西门子公司的Viva-E 血药浓度分析系统，检测方法为酶放大免疫法（enzyme- multiplied immunoassay technique，EMIT），检测原理是基于抗原（万古霉素）与酶标抗原竞争抗体从而由酶活力反映抗原浓度。目前临床常用的糖肽类抗菌药物有万古霉素、去甲万古霉素、替考拉宁，均具有相似的结构，其中万古霉素与去甲万古霉素在结构上仅相差一个甲基，万古霉素抗体可能会与抗原结构相似的去甲万古霉素分子结合，从而利用相同原理检测其浓度。

1 资料与方法

1.1 主要仪器

Viva-E 药物浓度检测仪（德国西门子公司）、10AT 高效液相分析系统（日本岛津公司）、Inertsil ODS-SP 色谱柱（日本岛津公司，4.6 mm×250 mm）、Academic 超纯水仪（Millipore 公司）、TDZ5-W S 离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）、Research plus移液器（Eppendorf公司，100 ～ 1000 μL、20 ～ 200 μL）。

1.2 实验试剂

去甲万古霉素标准品（中国药品生物制品检定所，规格：150 mg，批号：130338-200303）、替考拉宁标准品（中国食品药品检定研究院，规格：100 mg，批号：130374-201002）、甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司，规格：500 mL，批号：20170303）、磷酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司，规格：500 mL，批号：20170103）、三乙胺（分析纯，国药集团化学试剂有限公司，规格：500 mL，批号：20140728）、磷酸二氢钾（优级纯，国药集团化学试剂有限公司，规格：500 g，批号：20140627）、万古霉素检测试剂（酶放大免疫测定法，德国西门子公司，国械注进20162400276，批号：J5）、万古霉素检测定标液（德国西门子公司，国械注进20162400298，批号：J3）、治疗药物监测质控物（水平1，美国Bio-Rad公司，国械注进20122401399，批号：57341）、治疗药物监测质控物（水平2，美国Bio-Rad公司，国械注进20122401399，批号：57342）、实验用水为Academic超纯水仪制备。

1.3 实验方法

本实验应用EMIT法检测万古霉素血药浓度，考察浓度为20 μg·mL-1去甲万古霉素和替考拉宁是否能够对检测试剂进行有效响应，将具有有效响应的品种与高效液相检测结果进行比较，并对日间差异、定量下限等项目进行初步研究。

2 结果与分析

2.1 万古霉素检测试剂对20 μg·mL-1去甲万古霉素及20 μg·mL-1替考拉宁的响应情况

用空白血清分别配制去甲万古霉素、替考拉宁待测样本，每种药品各制备3份样本，浓度均为20 μg·mL-1。运用药物浓度检测仪万古霉素浓度检测模块对样品进行测量，3 份万古霉素样本检测结果分别为：20.4、21.0、19.5 μg·mL-1；3 份替考拉宁样本检测结果分别为：1.4、0.8、1.6 μg·mL-1。由实验结果初步推断，对于万古霉素检测试剂，去甲万古霉素具有较好的响应，替考拉宁响应微弱。

2.2 EMIT法与HPLC法检测去甲万古霉素血药浓度的差异

参照Viva-E 药物浓度检测仪中万古霉素标准曲线的建立流程，用空白血清分别配置去甲万古霉素浓度为0、5、10、20、30、50 μg·mL-1的样品作为定标液，由药物浓度检测仪自动模拟标准曲线，用空白血清配置去甲万古霉素浓度为4、8、12、16、24、28、32、36、40、44、48 μg·mL-1的样本并对其进行浓度检测，每个浓度样本平行制备3 个待测，平行检测两天（D1、D2）。为比较EMIT法与HPLC法的差别，我们参照EMIT法的标准曲线建立方法，用高效液相色谱法，对0、5、10、20、30、50 μg·mL-1的样品作为定标液，用外标法对4、8、12、16、24、28、32、36、40、44、48 μg·mL-1的样本进行浓度检测，每个浓度样本平行制备3 个待测。流动相为磷酸二氢钾缓冲液∶甲醇（80∶20）等浓度洗脱，流速为1 mL·min-1，检测波长为280 nm，检验结果见表1。EMIT法拟合曲线为二元三次方程，具体如下：Y = -10-8X3- 6×10-5X2+ 0.006 5 X + 0.272 9，R2= 0.999 4（D1）、Y = - 3×10-7X3- 3×10-5X2+ 0.006 X + 0.273 7，R² = 0.999 8（D2）；HPLC法拟合曲线为二元一次方程：Y = 5 378.8 X + 953.03，R² = 0.998 7。

将样本用HPLC法及两日EMIT法所测结果回收率进行配对t 检验，考察两种方法是否具有差异，结果显示P 值分别为0.467 8、0.342 0，均大于0.05，表明两种方法所得结果回收率无统计学差异。

2.3 EMIT 法检测去甲万古霉素血药浓度的日内及日间差异

12组不同浓度样品，每组平行制备3个样本待检测，应用EMIT法、HPLC法分别检测样本，回收率均在85% ～ 115%之间，与标准值差异均小于15%，各组间CV均小于15%，具体结果见表2。

将EMIT 法两日所测样本结果回收率进行配对t检验考察日间差异，结果P 值为0.603 9，大于0.05，表明两种方法日间差异无统计学意义。

2.4 EMIT法检测去甲万古霉素血药浓度的定量下限

低浓度样本组中，C、D、E、F组CV小于15%，仅F组各样本回收率在85% ～ 115%，其他各组均出现过偏差大于±15%的情况，因此本研究初步建议检测下限应≥3.0 μg·mL-1。

表1 去甲万古霉素不同浓度样本运用EMIT法与HPLC法的检测结果. n = 3Tab 1 Results of norvancomycin plasma concentration in different samples detected by EMIT and HPLC. n = 3

表2 低浓度样本EMIT法检测情况Tab 2 Results of low concentration samples detected by EMIT

3 讨论

3.1 可利用免疫法试剂盒的交叉反应检测抗原结构类似物

已有研究表明，市售免疫法试剂盒与部分抗原结构类似物存在交叉反应，如使用地高辛试剂盒检测杠柳毒苷[1]，使用庆大霉素试剂盒检测依替米星[2]。酶放大免疫法原理是样品中万古霉素和带有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的万古霉素（试剂1）竞争结合抗体（试剂2），通过检测酶活性下降程度来反映样品中的万古霉素浓度。根据我国药典中《生物样品定量分析方法验证指导原则》，配体结合分析方法应进行特异性实验，以考察结构相关物质或预期合用药物对方法的干扰。从另一个角度看，我们也可以利用其特异性方面的缺陷，来考察该方法是否可用于结构相关物质的浓度检测。

3.2 EMIT法适用于医疗机构检测患者去甲万古霉素血药浓度

由于万古霉素和去甲万古霉素机制用途相同，以原型经肾脏排泄在体内几乎不代谢，因此临床一般情况下在同一待测样本中不会彼此干扰。本研究结果显示，使用我院Viva-E 药物浓度检测仪进行检测去甲万古霉素线性较好，日间差异处于《中国药典》要求范围内，同时考虑到免疫法快速、灵敏、自动化程度高等优势，EMIT 法适用于医疗机构检测患者去甲万古霉素血药浓度。随着检测技术的发展，除了HPLC[3]、UPLC[4]等常用液相色谱技术，LC-MS/MS[5]、UPLC-MS/MS[6]等检测去甲万古霉素血药浓度的液质联用方法相继开发，各医疗机构可以根据实际情况选用合适的检测方法。

3.3 不同检测方法间去甲万古霉素血药浓度的差异探讨

本实验结果未显示HPLC法与EMIT法检验去甲万古霉素血药浓度存在显著性差异，在PubMed、中国期刊全文数据库、中国科技期刊数据库、数字化期刊全文数据库中检索到相关文献1篇，其结果表明两种方法的测定结果差异无统计学意义[7]，与本研究结果一致。在上述数据库中检索类似血药浓度检测方法学比较的文献，发现有研究显示检测万古霉素血药浓度时，HPLC法与荧光偏振免疫法（fluorescence polarization immunoassay，FPIA）可能存在显著性差异[8-9]。FPIA 与EMIT 均为目前常用的基于免疫学原理的药物浓度检测方法，根据本实验结果数据显示，在≥20 μg·mL-1的实验组中，也存在着EMIT 法测得值较HPLC法测得值偏高的问题，选取≥20 μg·mL-1区间数据进行配对t 检验比较时发现，EMIT、HPLC 测得值在上述区间存在显著性差异（EMIT法D1、D2与HPLC法标准偏差P值分别为0.000 012 3、0.000 365 4，均小于0.05），其原因可能为代谢降解产物的干扰所致[10]。因此，EMIT 法与HPLC 法是否存在差异可能受数据采集区间及样本数量影响，还需要更多真实世界的数据加以验证。

3.4 需要更多去甲万古霉素循证研究指导临床用药

目前利用去甲万古霉素血药浓度监测数据缺乏权威的药代/药效动力学数据及专业指南支持。而万古霉素有更多的临床、实验、循证证据，近年来推出了多部指南，对临床合理用药提供了有效帮助。去甲万古霉素与万古霉素抗菌谱相似，治疗效果相当，而去甲万古霉素在抗感染应用中的治疗成本明显低于万古霉素[11]。去甲万古霉素为我国主要研发生产的抗菌药物，具有很好的市场前景和临床需求，且在医保控费日趋严峻的现实情况下，优势明显。因此，临床需要科研及临床工作者提供更多的数据，应用血药浓度监测技术，指导临床用药，保障患者用药安全。