CYP3A5基因多态性对肾病患者他克莫司临床应用指导分析

李晓琳，刘 冰（.中国人民武装警察部队特色医学中心，天津 3006；.河北省人民医院，河北 石家庄 05005）

肾病是常见疾病的一种，发病多与免疫功能异常、炎症反应等有关，可导致患者肾功能严重下降，甚至引发肾衰竭[1]。目前临床上通常会通过免疫抑制剂对肾病患者进行治疗，他克莫司是常见的一种免疫抑制剂，此药物疗效有较大的个体化差异，患者对药物反应也完全不同，以常规的药物浓度监测来对药物剂量进行调整存在一定的局限性，难以有效预防药品不良反应的发生[2]。近年来，临床上发现CYP3A5酶属于他克莫司代谢的关键酶，基于此，临床上多通过检测CYP3A5基因多态性来对他克莫司的血药浓度、不良反应等进行分析[3]。本研究对接受他克莫司治疗的90 例肾病患者开展CYP3A5*3 多态性测定，探讨CYP3A 5*3 多态性对他克莫司浓度、不良反应的影响。

1 资料与方法

1.1 研究资料

1.1.1 病例资料 此次共纳入病例90 例，均为2016年6 月- 2017 年6 月在本院接受治疗的肾病患者，均为汉族。纳入标准：（1）符合难治性肾病综合征诊断标准；（2）耐受他克莫司治疗；（3）均很好的完成相应的治疗；（4）已配合签署知情同意书。排除标准：（1）合并其他器官、系统疾病；（2）应用他克莫司治疗前1个月使用过其他免疫抑制剂、细胞毒性药物；（3）存在大环内酯类抗生素使用禁忌症。患者性别：男性49例（54.44%），女性41例（45.56%）；年龄：26 ～ 67岁，平均（46.53±7.65）岁。此次研究已通过本院医学伦理会审批。

1.1.2 实验材料 （1）主要试剂：PuregeneDNA 提取试剂盒（德国Qingen 公司）；无水乙醇（上海振兴化工厂）；PCR 试剂盒（德国Qingen 公司）；引物合成购自上海英俊生物技术公司；DNA Marker、琼脂糖、5×TAE缓冲液（北京鼎国生物技术有限公司）；溴化乙淀（德国Boehringer Mannhein 公司）。（2）主要仪器：常温离心机（上海医用仪器厂）；紫外分光光度仪、Master cycler PCR 仪（Eppendorf 公司）；电泳仪（DYCP-31，北京六一仪器厂）；血药浓度监测仪（美国Abbott公司）。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 90 例患者均给予他克莫司（福建科瑞药业有限公司，批号：20160211）治疗，剂量3 ～ 4 mg·kg-1·d-1，口服，bid。

1.2.2 实验方法 （1）他克莫司血药浓度检测：给药12 h后，采集患者晨起空腹静脉血液标本，2 ～ 3 mL，常规抗凝处理，取200 μL血液标本与200 μL样本萃取液，置入离心管，摇晃5 ～ 10 s使其均匀，离心处理38 500 r·min-1，共5 min，取上清，置入化学发光免疫系统，测定血药浓度。

（2）CYP3A5基因多态性测定：①外周血DNA提取：采集患者晨起空腹静脉血液标本3 mL，对外周血基因组DNA进行提取：在1.5 mL EP管中加入20 μL蛋白酶K，并加入200 μL全血标本与200 μL裂解液，行15 s漩涡混匀处理，置入56 ℃水浴箱，进行10 min孵育，瞬时离心。将200 μL乙醇加入，行15 s 漩涡混匀处理，瞬时离心，将以上内容转移至2 mL收集管中，离心处理8000 r·min-1，1 min，去除滤液。在新收集管内加入500 μL 裂解液，离心处理14 000 r·min-1，3 min，去除滤液，转移至另一收集管，离心14 000 r·min-1，1 min。在1.5 mL离心管中置入收集管圆柱，去除滤液，加入200 μL蒸馏水，置于室温下5 min，离心处理8000 r·min-1，1 min，去除滤液即可得到DNA。通过紫外分光光度法对DNA浓度进行测定。②DNA的OD 值测定：取DNA 提取液5 μL，加入195 μL 纯水进行稀释处理，通过紫外分光光度计对OD值进行测定。③CYP3A5基因多态性检测：通过聚合酶链式反应-序列特异性引物分析技术对基因进行扩增，在PCR管中置入25 μL工作液、3 μL DNA，混匀。在引物板每孔中加入10 μL以上混合液，将15 ～ 20 μL石蜡油加入，封板。循环参数：96 ℃ 2 min，96 ℃ 20 s，60 ℃ 1 min，共循环5次；96 ℃ 20 s，65 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，共进行10个循环；96 ℃ 20 s，63 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，共循环15次；72 ℃ 2 min。对循环末的荧光信号进行收集，并展开溶解曲线分析。

1.3 结果判定

对每个孔的Ct 值、特征性熔解曲线导数峰进行记录，Ct 值在10 以上，22 及以下，或D（1）/D（2）在1.5及以下为阳性；Ct在22以上，或者D（1）/D（2）在1.5以上为阴性。1孔阳性，2孔阴性为*1/*1型；1孔、2孔均为阳性为*1/*3型；1孔阴性，2孔阳性为*3/*3型。

1.4 观察指标

（1）90 例患者CYP3A5 基因类型。（2）不同基因型患者用药后1 个月、6 个月、12 个月时的血药浓度、日剂量、血药浓度与日剂量比值（血药浓度/日剂量）。（3）不同基因型患者不良反应发生情况，主要包括肝损伤、高血糖、血液毒性、高血压、胃肠道反应等他克莫司引发的不良反应。（4）CYP3A5基因多态性与他克莫司不良反应的相关性。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 患者基因类型

90例患者中，21例为*1/*1型（23.33%），29例为*1/*3型（32.22%），40例为*3/*3型（44.44%）。

2.2 不同基因型患者血药浓度

用药后1 个月、6 个月、12 个月，*1/*1 型、*1/*3型患者血药浓度、血药浓度/日剂量均较*3/*3型患者低，且*1/*1型、*1/*3型日剂量较*3/*3型患者高，差异有统计学意义（P ＜ 0.05），见表1。

2.3 不同基因类型患者不良反应发生情况

*1/*1 型、*1/*3 型患者不良反应发生率较*3/*3型患者低，差异有统计学意义（P ＜ 0.05），见表2。

2.4 CYP3A5基因多态性与他克莫司不良反应的相关性

90 例患者，共27 例发生不良反应，对其不良反应可能的影响因素展开单因素分析，发现发生不良反应者与未发生者在性别、年龄、尿蛋白定量、血清肌酐方面，差异无统计学意义（P ＞ 0.05），发生不良反应者血药浓度较未发生者高，发生不良反应患者的*3/*3型基因所占比例较未发生者高，差异有统计学意义（P ＜ 0.05），见表3。

依据表3，以平均血药浓度、*1/*1 型、*1/*3 型、*3/*3 型基因为变量展开Logistic 回归分析，发现*3/*3型CYP3A5 基因是导致不良反应发生的主要影响因素，见表4。

3 讨论

他克莫司是肾小球疾病治疗的主要药物，此药物能够与细胞受体进行结合，促使靶细胞内蛋白磷酸化、钙离子通道信息传递改变，进而发挥免疫抑制作用，达到改善疾病的效果[4]。他克莫司进入血液后，主要通过细胞色素P450酶系的CYP3A亚家族进行代谢，不同个体对他克莫司的生物利用度存在较大差异性，因此肾小球疾病患者通过他克莫司治疗的效果、安全性存在个体性[5]。以往临床上多通过血药浓度测定来确定他克莫司剂量，但此方法有一定局限性，无法实现他克莫司剂量的精准控制。因此，近年来临床上多对CYP3A5 基因多态性进行分析，个体化用药，以对他克莫司剂量进行精准化控制，在达到预期效果的同时，减少不良反应的发生。CYP3A5主要表达于肝脏、肾脏、小肠中，其中肝内占30%左右，肠内占70%以上，参与药物代谢的CYP3A 占60%以上。人体内的CYP3A 亚型主要有CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7等，其中参与他克莫司代谢中的主要为CYP3A4、CYP3A5，CYP3A3水平高低直接影响他克莫司生物利用度[6]。

近年来，关于基因多态性的研究不断深入，临床上越来越重视个体基因水平与药物代谢之间的关联性。大量临床研究表明CYP3A5基因多态性直接影响他克莫司的血药浓度，对肾小球疾病患者采用他克莫司进行治疗时，临床上逐渐重视CYP3A5基因多态性检测[7-8]。齐林等[9]关于CYP3A5 基因多态性与他克莫司血药浓度相关性的研究以肾移植患者为对象，结果显示*3/*3 型基因患者血药浓度、术后不良反应发生率最高。本次研究以肾小球疾病患者为研究对象，探讨不同CYP3A5基因类型患者他克莫司血药浓度与不良反应发生情况，结果显示，用药后1 个月、6 个月、12个月，*1/*1型、*1/*3型患者血药浓度、血药浓度/日剂量均较*3/*3型患者低，且*1/*1型、*1/*3型日剂量均较*3/*3型患者高，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。结果提示，若肾小球疾病患者口服相同剂量的他克莫司，*1/*1型、*1/*3型患者血药浓度低于*3/*3型患者，为达到预期疗效，1/*1型、*1/*3型患者需服用更多的剂量，才可达到与*3/*3型患者相同的血药浓度。

表1 不同基因型患者血药浓度对比Tab 1 Comparison of blood concentration of patients with different genotypes

表2 不同基因类型患者不良反应发生情况对比.例（%）Tab 2 Comparison of adverse reactions in patients with different gene types. case(%)

表3 90例患者不良反应影响因素的单因素分析Tab 3 Univariate analysis of factors influencing adverse reactions in 90 patients

表4 Logistic回归分析结果Tab 4 Results of logistic regression analysis

此外，本次研究结果还显示，在不良反应发生率方面，*1/*1型患者是19.05%，*1/*3型是24.14%，均较*3/*3 型的40.00%低，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。CYP3A5 基因位于人类第7 号染色体，共包含外显子13 个，长31.8 kb，属于高度变异基因之一，突变点位较多，包括CYP3A5*2、CYP3A 5*3、CYP3A5*4 等，其中在各种族人群中发生频率最高的是CYP3A5*3[10]。CYP3A5*3突变可导致CYP3A5 mRNA 出现可变性的剪切，生存不稳定截断蛋白质，因此携带CYP3A5*3/*3 基因的人体无法对存在酶活性的CYP3A5 蛋白质进行表达，此类人群便属于他克莫司慢代谢型。采用他克莫司治疗肾小球疾病时，CYP3A5*1/*1型基因患者有明显的清除优势存在，可导致他克莫司代谢增加，使药物暴露降低，因此药品不良反应较少。而CYP3A5*3/*3 型基因患者无法对他克莫司进行充分性代谢，虽然仅需要低剂量的他克莫司即可达到血药浓度，但不良反应发生率较高。本次研究采用Logistic回归分析，发现*3/*3型CYP3A5基因是导致肾小球疾病患者接受他克莫司治疗时发生不良反应的主要影响因素。因此，建议临床在采用他克莫司对肾小球疾病患者进行治疗时，可对患者CYP3A5基因多态性进行检测，依据检测结果对他克莫司剂量进行确定，以达到提升疗效、降低不良反应发生率的效果。

综上所述，CYP3A5基因多态性直接影响肾小球疾病患者他克莫司血药浓度与不良反应，*3/*3 型患者血药浓度、不良反应发生率均高于*1/*1 型、*1/*3型患者。由于此次研究样本量较小，仅开展回顾性研究，尚需增加样本量展开大量研究，以进一步探讨CYP3A5基因多态性与肾小球疾病患者他克莫司血药浓度、不良反应的相关性。