APP下载

右美托咪定预处理对脓毒症小鼠肺组织炎症及相关因子表达的影响

2019-07-12卢光涛林学正尧章泉王均炉

温州医科大学学报 2019年8期
关键词:趋化因子磷酸化脓毒症

卢光涛,林学正,尧章泉,王均炉

(1.温州医科大学附属第一医院 麻醉科,浙江 温州 325015;2.台州市中心医院 麻醉科,浙江 台州 318000)

脓毒症(sepsis)是由感染引起的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),为严重创伤、烧伤、休克、大手术后的常见并发症,具有高发病率、高致死率的特 点[1-2]。脓毒症主要激活机体单核/巨噬细胞系统及其他炎症反应细胞,产生并释放大量炎症因子,如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-8等,引起炎性细胞浸润,导致组织损伤,血流动力 学改变和多器官衰竭,最终可能导致患者死亡[3-4]。右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)是一种高度选择性的α2肾上腺素能受体激动剂,广泛用于手术室或ICU患者围术期的镇静和镇痛[5-6]。近年来有研究发现DEX还具有调节机体免疫和降低炎症反应等作用[7-9],但作用机制尚未完全阐明。本研究通过观察DEX对脓毒症模型小鼠肺组织中相关炎症因子表达及信号通路的影响,探讨DEX对脓毒症肺保护的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与分组:清洁级雄性成年C57BL/6小鼠70只,6~8周龄,体质量18~22 g,全部购自南京大学模式动物研究所。脓毒症实验40只,生存率实验30只,脓毒症试验随机分为4组:正常对照组(C组)、脓毒症组(S组)、中剂量DEX组(MD组)和高剂量DEX组(HD组),每组各10只小鼠;生存率实验随机分为3组:LPS组、中剂量DEX预处理组和高剂量DEX预处理组,每组各10只小鼠。所有实验小鼠均遵照实验动物的护理和使用指南进行。

1.1.2 药品及试剂:ELISA检测试剂盒购自美国R&D公司;注射用盐酸右美托咪定购自江苏恒瑞医药股份有限公司;细菌脂多糖(LPS)购自美国Sigma公司;NF-κB p-p65、p-IκBα、p-AKT及相应总蛋白的一抗和二抗购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 脓毒症和生存率实验:脓毒症实验中,MD和HD组小鼠尾静脉分别注射DEX溶液25和50 μg/kg, C组和S组注射等量0.9%氯化钠溶液。30 min后模型组小鼠尾静脉注射15 mg/kg LPS,C组注射等量0.9%氯化钠溶液。生存率实验中,中剂量DEX预处理和高剂量DEX预处理组小鼠尾静脉分别注射DEX溶液25和50 μg/kg,LPS组小鼠注射等量0.9%氯化钠溶液,30 min后3组小鼠尾静脉注射15 mg/kg LPS。每隔24 h观察小鼠存活情况,记录各组小鼠7 d的存活率[10]。

1.2.2 标本采集:LPS注射6 h后处死小鼠,用带针头的肝素化注射器从右心室静脉采集血样,4 ℃恒温4 000 r/min离心10 min,取血清置于-20 ℃ 冰箱保存。肺组织在预冷的0.9%氯化钠溶液中制成组织匀浆,随后用1 mL动物组织总蛋白提取液提取组织总蛋白(上海碧云天生物技术有限公司),4 ℃恒温14 000 r/min离心15 min,取上清液于-80 ℃冰箱中保存。每组再各取4只小鼠收集肺组织样本,左肺组织离体后用电子天平称重,之后用锡纸包裹置于65 ℃恒温干燥箱中烘干72 h测重,右肺梯度脱水后制成石蜡切片。

1.2.3 观察指标:用ELISA试剂盒检测血清样品中TNF-α、CXCL1、CXCL5和CCL20的含量;Western blot检测组织匀浆上清液中AKT及NF-κB(p65、IκBα) 的磷酸化蛋白以及总蛋白表达水平,使用Quantity One软件对曝光条带的光密度值进行定量测定。左肺组织烘干后称重,计算湿/干重比(wet weight/dry weight ratio,W/D)和总肺含水量(total lung water content,TLW)。肺组织石蜡切片用于HE染色,在显微镜下观察并分析肺损伤程度。所有实验操作均严格按照试剂盒说明书步骤进行。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析,计量资料以s表示,多组间比较用单因素方差分析,组间两两比较用LSD-t法;计数资料比较用χ2检验;采用Graphpad Prism 7.0软件绘制生存曲线并分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组小鼠血清中TNF-α、CXCL1、CXCL5和CCL20的含量变化 与C组比,LPS诱导的脓毒症小鼠血清中TNF-α、CXCL1、CXCL5和CCL20含量显著增加,差异有统计学意义(均P<0.01)。与S组比,MD和HD组小鼠血清中TNF-α、CXCL1、CXCL5和CCL20的含量均有显著下调,差异有统计学意义(均P<0.01),且HD组效果最显著,差异有统计学意义(均P<0.01)。见图1。

2.2 4组小鼠肺组织中AKT和NF-κB信号通路活性变化 与C组比较,S组小鼠肺组织中AKT、NF-κB p65和IκBα磷酸化水平(磷酸化蛋白/总蛋白)显著增加,差异有统计学意义(均P<0.05);S组高于MD组,MD组高于HD组,并且HD组磷酸化抑制水平最为显著,差异有统计学意义(均P<0.05),见图2。

图1 LPS诱导的脓毒症小鼠血清中TNF-α、CXCL1、CXCL5和CCL20的含量变化(n=10)

2.3 4组小鼠肺组织W/D、TLW及肺损伤情况 与C组比,S组和MD组肺组织中W/D和TLW均显著上升,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。HE染色结果显示,S组肺组织病理改变,包括炎性浸润、间质水肿、肺泡壁增厚;而MD和HD组肺组织形态学紊乱减轻,见图3。

2.4 3组右美托咪定促生存实验 与LPS组小鼠在 3 d内全部死亡相比,高剂量DEX预处理组小鼠7 d存 活率达40%,差异有统计学意义(P<0.05),见图4。

3 讨论

在脓毒症引起的多器官功能障碍综合征中,肺是第一个受到攻击并可能衰竭的器官[11-12]。脓毒症能够引起炎症细胞的大量表达,激活机体内的炎症反应,因此抑制过度的炎性反应已成为治疗脓毒症肺损伤的重要方式。TNF-α和IL-6为炎症中重要的启动因子,也是目前研究最广泛的一类炎性细胞因子[13]。趋化因子是机体内能使白细胞发生趋化运动的一类小分子细胞因子,在炎症反应中同样发挥着重要作用。其中,CCL20和CXCL1、CXCL5分别是趋化因子CC家族和CXC家族中的重要成员,与机体炎症及免疫反应密切相关。在炎症初期,CXCL1和CXCL5负责招募中性粒细胞,CCL20则负责招募巨噬细胞,造成炎症细胞浸润引发炎症[14-15]。DEX是一种高选择性的α2肾上腺素受体激动剂,主要通过激活脑干蓝斑核内的α2肾上腺素受体,抑制交感神经兴奋,产生镇静、镇痛和抗焦虑的作用[16]。近年来有研究发现DEX还具有抗炎和调节机体免疫作用,具有一定的器官保护作用[17-18]。

本研究以LPS诱导的脓毒症C57BL/6小鼠为研究模型,在LPS诱导脓毒症模型前用不同浓度的DEX预处理小鼠。造模6 h后S组小鼠血清中TNF-α、CXCL1、CXCL5和CCL20的含量显著增加,说明LPS给药后小鼠出现了大量的炎性细胞浸润;而DEX预处理可以有效抑制上述炎症因子的表达,且50 μg/kg的DEX效果最显著。DEX预处理还能显著降低肺组织W/D和TLW,减轻肺组织损伤程度。这些结果均表明DEX可以减轻脓毒症小鼠的肺水肿和降低炎性细胞浸润。为进一步研究DEX的抗炎作用分子机制,我们对模型小鼠肺组织中的炎症相关信号通路进行了探究。结果发现DEX预处理能有效抑制p65、IκBα及AKT的磷酸化,说明DEX可能通过下调NF-κB和AKT信号通路来发挥一定的抗炎作用,从而对肺组织起一定的保护作用。此外,本实验研究表明:DEX预处理在降低肺组织炎症的同时还能显著提高脓毒症小鼠的存活率。

图2 4组小鼠肺组织AKT、NF-κB p65和IκBα磷酸化水平比较(n=10)

表1 4组小鼠肺组织W/D和TLW结果比较(每组n=10,)

表1 4组小鼠肺组织W/D和TLW结果比较(每组n=10,)

与C组比:aP<0.05;与S组比:bP<0.05

?

图3 4组小鼠肺组织形态学观察结果(HE,×400)

图4 DEX预处理对LPS诱导脓毒症小鼠存活率的影响(n=10)

趋化因子是引起炎性细胞迁移最直接最迅速的效应因子,由于其往往出现在炎症的初期,又被称为炎症早期分子。趋化因子自身还可以招募更多的炎症细胞分泌IL-1β、IL-6等炎症因子,因此在炎症反应中具有重要作用[19-20]。目前关于DEX用于脓毒症肺损伤的研究大多集中在白细胞介素类促炎细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-10等),而对趋化因子的研究比较少[5,16]。本研究初步发现DEX可以通过降低AKT/NF-κB信号通路活性来抑制炎症相关趋化因子的表达,延长脓毒症小鼠的存活时间,且呈现一定的浓度依赖性。

综上所述,DEX可通过下调AKT/NF-κB分子信号通路抑制LPS诱导的脓毒症小鼠体内炎症因子的表达,减轻肺组织的炎症和损伤,从而发挥对脓毒症小鼠肺组织的保护作用。此外,DEX预处理还能显著提高脓毒症小鼠的存活率。

猜你喜欢

趋化因子磷酸化脓毒症
清热解毒法干预脓毒症的临床观察*
急诊脓毒症患者呼吸窘迫综合征发生的影响因素
T69E模拟磷酸化修饰对Bcl-2与Nur77相互作用的影响
GDM孕妇网膜脂肪组织中Chemerin的表达与IRS-1及其酪氨酸磷酸化分析
长链非编码RNA GASL1在脓毒症患者中的表达及其诊断意义
血清IL-6、APC、CRP在脓毒症患者中的表达及临床意义
基于CRISPR—Cas9定向编辑CCL17和CCL22基因的研究
咪喹莫特调节Th1、Th2细胞相关趋化因子对兔耳增生性瘢痕创面愈合和瘢痕增生的影响
石仙桃多糖对肺炎支原体感染模型小鼠肺泡灌洗液中趋化因子表达的影响
磷酸化肽富集新方法研究进展