胃癌组织幽门螺杆菌vacA基因型的分布及其与CDX2表达的关系

梁莉 薄威 张忠

[摘要] 目的 筛查辽宁地区胃癌患者幽门螺杆菌（Helicobacte pylori，H.pylori）vacA优势基因型并了解其对CDX2表达的影响，为胃癌的发生机制及因型施治提供实验室依据。 方法 采用GT pureTMFFPE tissue DNA Extraction KIT试剂盒提取173例H.pylori阳性石蜡包埋胃癌组织的DNA;采用PCR检测H.pylori不同vacA基因型分布情况，采用免疫组化方法检测胃癌组织CDX2蛋白表达。 结果 在胃癌中vacAs1，vacAm1，vacAs1m1亚型分布高于其他亚型（P<0.05），其中vacAm1，vacAs1m1与肿瘤分化程度密切相关，二者在高分化组的分布低于中低分化组（P<0.05），vacAm1在男性患者中分布高于女性（P<0.05）;年龄大于60岁、高分化和肠型胃癌与CDX2的表达呈正相关（P<0.01）;CDX2的低表达与vacAm1，vacAs1，vacAs1m1基因型密切相关（P<0.05）。 结论 vacAm1，vacAs1与vacAs1m1是辽宁地区胃癌发生的优势基因型，vacAs1m1阳性的H.pylori患者及男性vacAm1 H.pylori阳性感染者可能抑制CDX2的表达进而促进胃癌的恶性分化。

[关键词] 胃癌;幽门螺杆菌;空泡毒素基因;尾型同源框转录因子2

[中图分类号] R735.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）13-0005-05

[Abstract] Objective To screen the dominant vacA genotypes of Helicobacte pylori（H.pylori） in gastric cancer patients in Liaoning and to understand its effect on CDX2 expression， in order to provide laboratory evidence for the mechanism and treatment of gastric cancer. Methods 173 pure H.pylori-positive paraffin-embedded gastric cancer tissues were extracted with GT pureTM FFPE tissue DNA Extraction KIT kit. PCR was used to detect the distribution of different vacA genotypes of H.pylori， and the expression of CDX2 protein in gastric cancer tissues was detected by immunohistochemistry. Results The distribution of vacAs1， vacAm1 and vacAs1m1 subtypes in gastric cancer was higher than that of other subtypes（P<0.05）. Among them， vacAm1 and vacAs1m1 were closely related to the degree of tumor differentiation， and the distribution of the two in the highly differentiated group was lower than that in the moderately and poorly differentiated group（P<0.05）. vacAm1 was higher in male patients than in females（P<0.05）. Age greater than 60 years， high-differentiation and intestinal type gastric cancer were positively correlated with CDX2 expression（P<0.01）. Low expression of CDX2 was closely related to vacAm1， vacAs1 and vacAs1m1 genotypes（P<0.05）. Conclusion vacAm1， vacAs1 and vacAs1m1 are the dominant genotypes of gastric cancer in Liaoning. The vacAs1m1-positive H.pylori patients and male vacAm1 H.pylori positive infectors may inhibit the expression of CDX2 and promote the malignant differentiation of gastric cancer.

[Key words] Gastric cancer;Helicobacter pylori;Vacuolating toxin gene;Cadual-related homeobox transcription factor 2（CDX2）

胃癌是世界上最常見的恶性肿瘤之一，据最新统计显示其死亡率仍处于世界肿瘤排名第三位[1]。据流行病学显示幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）感染与胃癌的发生密切相关[2]，其释放的多种毒力因子为主要致病因素，目前研究较为广泛的是空泡毒素基因（vaculating toxin gene A，vacA），其基因序列上存在信号区（s1，s2）和中间区（m1，m2），可将H.pylori分为s1m1、s1m2、s2m1和s2m2四种基因亚型，这些基因亚型的分布可因地域的不同而不同，且与胃癌的关系不同[3，4]。目前其基因型在辽宁地区胃癌患者的分布尚不清楚，该基因型如何导致胃癌的发生尚需研究。

尾型同源框转录因子2（cadual-related homeobox transcription factors 2，CDX2）是同源框基因家族中的一员，作为一种肠上皮特异性标志物，在正常的肠上皮细胞中表达，而在正常胃上皮细胞中不表达，有研究表明CDX2表达对胃癌尤其是肠型胃癌的发生发展发挥着重要作用。在研究CDX2与胃癌发生相关性时，人们发现H.pylori的另一毒力因子CagA[5，6]感染可影响CDX2表达情况进而促使胃癌的发生发展。但cagA基因仅存在于部分H.pylori中，而vacA基因存在于所有的H.pylori，关于vacA基因亚型对CDX2表达的影响尚不清楚。因此，本研究将通过检测不同亚型的H.pylori vacA基因在辽宁地区胃癌患者中的分布及其对CDX2的表达影响，筛选辽宁地区胃癌患者H.pylori vacA的优势基因型及其与CDX2表达之间的关系，从而为胃癌的发生机制及因型施治提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1 样本资料

本研究选取2010年1月～2014年12月沈阳医学院附属中心医院外科手术切除的H.pylori阳性的胃癌石蜡包埋组织样本173例，其中男137例，女36例，年龄24～87岁，中位年龄60岁，本研究所得样本已通过沈阳医学院伦理委员会批准。

1.2 试剂盒提取石蜡组织DNA

石蜡组织中DNA提取采用GT pureTMFFPE tissue DNA Extraction KIT试剂盒（北京天根生化科技），石蜡组织标本连续切片10～12片，厚度5 μm/片，置于1.5 mL离心管中，按照试剂盒说明书操作。提取的DNA样本，-20℃储存备用。

1.3 PCR检测H.pylori vacA不同基因亚型

H.pylori vacAs1，vacAs2，vacAm1，vacAm2特异引物（上海生工合成），分别进行巢式PCR扩增，相关特异性引物序列见文献[7]。反应体系均为25 μL，包括模板DNA 2 μL，2×Taq Master Mix（江苏溥博公司）12.5 μL，引物1.25 μL，蒸馏水补足至25 μL。巢式PCR反应条件：①vacAs1反应条件：95℃ 5 min，（95℃ 1 min，54℃ 1 min，72℃ 1 min）40 cycle，72℃ 1 min，4℃;其余基因亚型反应条件：第一次扩增条件为95℃ 5 min，（95℃ 1 min，54℃ 1 min，72℃ 1 min）35 cycle，72℃ 1 min，4℃;第二次扩增条件为95℃ 5 min，（95℃ 1 min，54℃1 min，72℃ 1 min）30 cycle，72℃ 1 min，4℃。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像分析结果。

1.4 免疫组化（ElivisionTM plus法）

采用ElivisionTM plus法检测CDX2蛋白表达，鼠抗人CDX2单抗购买自北京中杉金桥，相关试剂盒购买自福州迈新公司。CDX2一抗以1：100比例稀释滴加，4℃过夜，以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知阳性组织作为阳性对照，步骤参照试剂盒说明书。

1.5 免疫组化评分标准

免疫组化染色为胞核阳性，主要评价杯状细胞与柱状细胞的染色情况。评分标准：根据染色程度，无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分;根据染色细胞数，<10%为0分，10%～30%为1分，30%～50%为2分，>50%为3分;将染色程度与阳性细胞数评分相加，0分为阴性（-），1～2分为弱阳性（+），3～4分为中阳性（++），5～6分为强阳性（+++）。将阴性与弱阳性评为阴性，中阳性与强阳性评为阳性。

1.6 统计学分析

应用SPSS 16.0进行统计分析，采用χ2检验与Logistics回归分析H.pylori vacA基因型与胃癌分化程度、CDX2表达之间相关性，P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示差异有高度统计学意义。

2 結果

2.1 临床病理资料

本研究选取173例沈阳医学院附属中心医院外科手术切除的H.pylori阳性胃癌患者组织，相关临床病理资料如下表所示，因本组病例年龄呈偏态分布，所以取中位年龄60岁为界，年龄>60岁95例，年龄≤60岁78例;其余分组均根据文献[8，9];男性胃癌患者137例，是女性患者的3.8倍;肿瘤直径<5 cm 86例，直径≥5 cm 87例;按照肿瘤分化程度，中分化（67/173，38.73%）与低分化（81/173，46.82%）胃癌患者高于高分化组（25/173，14.45%）胃癌患者;有淋巴结转移患者128例，占73.99%;按照Lauren分型，肠型胃癌93例，占53.76%，弥漫型胃癌80例，占46.24%。见表1。

2.2 不同H.pylori vacA基因亚型在胃癌中的分布

经PCR凝胶成像显示有亮带出现即为H.pylori vacA基因阳性，反之为阴性，其中vacAs1片段长度为141bp;vacAs2片段长度为153bp;vacAm1片段长度为102bp;vacAm2片段长度为181bp。

单独分析各亚型分布结果显示，vacAs1亚型（109/173，63.01%）在胃癌中的分布高于vacAs组其他亚型，差异有统计学意义（P<0.05）;vacAm1亚型（63/173， 36.99%）在胃癌中的分布高于vacAm组其他亚型，差异有统计学意义（P<0.05）;合并分析vacAs亚型与vacAm亚型，vacAs1m1亚型（44/173，25.43%）在胃癌中表达率均高于其他亚型，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 H.pylori vacA优势基因型与胃癌患者不同分化程度的关系

比较H.pylori vacA不同基因亚型及临床病理资料发现，H.pylori vacA不同基因亚型仅与分化程度和性别有关。其中，vacAm1和vacAs1m1基因型与分化程度密切相关（P<0.05），进一步分层分析显示在中低分化组的分布明显高于高分化组（表3），差異均有统计学意义（P<0.05）。vacAm1与性别密切相关，且男性（56/64，87.5%）高于女性（8/64，12.5%），具有统计学差异（P<0.05），其他组无显著统计学差异。

2.4 CDX2表达与胃癌患者临床病理特性的关系

结果显示，CDX2的表达与性别、肿瘤直径、大体分型、浸润深度及淋巴结转移均无关，差异无统计学意义（P>0.05）;但其表达与年龄、肿瘤分化程度、Lauren分型密切相关，其中年龄>60岁患者CDX2表达明显高于≤60岁者，差异有高度统计学意义[经年龄性别调整后OR=2.738，95%CI=（1.304～5.737），P<0.01];同样在高分化组中CDX2的表达明显高于中分化与低分化组，差异有高度统计学意义[经年龄性别调整后OR=15.114，95%CI=（3.338～68.432），P<0.01];CDX2的表达在肠型胃癌组明显高于弥漫性胃癌组，具有高度统计学差异[经年龄性别调整后OR=3.143，95%CI=（1.682～5.872），P<0.01]。见表4。

2.4 H.pylori vacA优势基因型与CDX2表达的关系

进一步分析H.pylori vacA优势基因型与CDX2表达之间的关系，结果显示，CDX2表达与H.pylori vacAs1，vacAm1，vacAs1m1亚型密切相关，差异有统计学意义（P<0.05），并且当此三种基因型为阳性时，CDX2阳性表达率均明显降低。见表5。其余vacA基因亚型与CDX2表达无统计学差异（P>0.05），未在表中列出。

3 讨论

胃癌作为全球高发病率高死亡率的恶性肿瘤之一，其发生发展与H.pylori感染密切相关。大量国内外研究显示，在胃病患者的胃黏膜中可检测出H.pylori，仅有少数H.pylori感染者会出现胃癌等严重的临床结局[9]，究竟何种H.pylori感染可引起胃癌的发生，其作用机制已成为亟待研究的重点。目前研究表明，H.pylori不同分离株间存在巨大的遗传差异，这些遗传学的差异影响着H.pylori毒力因子的功能、抗原性[10-12]及致病性，导致不同基因型组合与疾病的关系不同。有关H.pylori毒力因子的研究中，vacA基因与胃癌的关系成为关注焦点，由于其基因序列上存在多态性位点，决定了携带不同vacA等位基因亚型的H.pylori菌株毒力及致病性不同。目前研究认为[3，13]，vacAs1m1基因型的H.pylori菌株可产生更高水平的毒素，是H.pylori致病性的标志，与胃癌的发生密切相关，但存在着地域差别。另有研究表明，vacAs1m2基因型菌株也可释放大量毒素，且与胃癌癌前病变的发生密切相关[14]，但尚未有相关胃癌的研究;vacAs2m2亚型编码的蛋白无活性。因此本研究通过单独/联合检测辽宁地区胃癌组织不同vacA基因亚型的分布发现，vacAs1、vacAm1与vacAs1m1基因亚型在胃癌中的分布高于其他亚型，提示在辽宁地区这些基因型与胃癌发生密切相关，是胃癌发生的优势基因型，与大部分的文献报道[15，16]结果一致，不同点在于文献中大多采用是菌培养的方法进行分析，而本次研究所用DNA样本均来自石蜡包埋组织，可以更好地体现H.pylori在人体中的生长情况，为分析胃癌中vacA基因亚型的分布提供了便利。

在此基础上进一步分析vacA基因型与胃癌临床特性的关系，结果显示vacAm1和vacAs1m1基因型在高分化组分布低于中、低分化组，其他基因型与胃癌的分化无关，提示vacAm1和vacAs1m1基因型与胃癌发生中、低分化密切相关。同时还发现vacAm1在男性胃癌患者中的分布显著高于女性，提示该基因型可能是导致男性患者发生胃癌的毒力因子，具体原因尚需进一步研究。

为进一步探讨这些优势基因型与胃癌发生的关系，本研究选取与胃癌发生密切相关的转录因子CDX2进行研究。本研究结果显示，CDX2表达与60岁以上、肠型胃癌和高分化胃癌密切相关，而与性别、浸润深度、肿瘤直径和淋巴结转移无关。提示CDX2作为一个反映细胞分化成熟的指标在胃癌，特别是高分化肠型胃癌中发挥重要的指示作用。CDX2的表达提示胃癌分化成熟，具有肠表型特征。大量国内外研究显示CDX2在胃癌组织中呈高表达[17-19]。无论胃癌发展到何阶段，具有肠表型的胃癌（CDX2蛋白表达和相对mRNA水平）均明显高于具有胃表型的胃癌，并且研究显示CDX2阳性表达的胃癌分化程度好，淋巴结转移少，存活时间长，预后较好[20]。

在此基础上，进一步分析vacA不同基因型对CDX2表达的影响，结果显示仅vacAs1、vacAm1与vacAs1m1三个优势基因型与CDX2的表达呈负相关，结合vacAm1和vacAs1m1基因型与胃癌临床关系的研究，提示vacA具有较强毒力的基因型可抑制CDX2表达，从而导致胃黏膜组织出现中、低分化。关于这方面的直接作用机制研究尚未见报道，需要进一步研究。但是有研究显示CDX2过度表达可抑制IL-6/STAT3通路，进而抑制cyclin-D1、survivin、Bcl-2表达，促进Bax表达，抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖[21];外源性CDX2作用于CDX2缺陷的胃癌细胞后，细胞发生明显的形态学改变和严重的生长抑制[22]，进一步表明CDX2在胃癌细胞中可抑制肿瘤的恶性生长。此外，已有研究证明H.pylori感染对CDX2的表达具有一定影响。目前有大量体内外研究证实H.pylori感染可通过多种作用机制诱导CDX2的表达，Asano N等[2]研究显示在AGS细胞中，H.pylori感染后诱导的Cdx2表达依赖于NF-κB，进而促进胃癌癌前病变的发生;另外体外的实验研究[23]显示H.pylori特别是CagA阳性（含有致病岛）的菌株能引起胃癌细胞系（AGS、NUGC-4、KATOIII）CDX2蛋白水平和mRNA水平增高，Camilo V等[24]选用两种H.pylori菌株（26695有致病岛，TX30无致病岛）共同感染AGS细胞，24 h后加入BMP2，结果显示在266695菌株中BMP2及下游蛋白SMAD4和p-SMAD1/5/8增高，同时CDX2水平均增高，动物实验进一步证实H.pylori可通过BMP途径上调CDX2，下调SOX2，进而影响胃癌的发生发展，但是多局限于cagA基因亚型上。

综上，本研究认为vacAs1、vacAm1与vacAs1m1为辽宁地区胃癌发生的优势基因型，携带此三种基因型尤其是60岁以上，vacA s1m1阳性的H.pylori患者及男性vacAm1 H.pylori感染可能抑制CDX2的表达进而促进胃癌的恶性分化，对于这部分人群相关作用机制尚需进一步深入研究。

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（收稿日期：2018-12-25）