130株致泻性大肠埃希菌耐药谱分析

詹彩梅，梁冬红，梁敏仪 [广东医科大学附属第三医院(佛山市顺德区龙江医院)，广东佛山 528318]

大肠埃希菌(Escheoiehia coli,E. coli) 是肠道重要的正常菌群，为宿主提供一些具有营养作用的合成代谢产物。而致泻性大肠埃希菌 (Diarrheagenic E.coli, DEC)是引起感染性腹泻流行和地方腹泻暴发的主要病原体[1-2]。目前细菌性肠道感染的治疗主要依赖于抗菌药物，由于抗菌药物的广泛使用与滥用，致使细菌耐药性越发严重。为了解佛山市某地区细菌性腹泻病的特征，掌握腹泻患者DEC的耐药谱分布，以及为临床合理用药提供依据，本研究拟应用纸片扩散试验(K-B法)对佛山市某医院腹泻患者的肛拭子进行耐药性分析。

1 材料和方法

1.1 样本来源

受试的130株大肠埃希菌为2016年1月至2017年10月分离自佛山市某医院健康体检样本。

1.2 方法

1.2.1 实验材料 22种药敏纸片均为Oxoid公司生产，包括氨苄西林(AMP)、阿莫西林(AMC)、氨苄西林(SAM)、头孢吡肟(FEP)、头孢噻肟(CTX)、头孢西丁(FOX)、头孢他啶(CAZ)、头孢曲松(CRO)、头孢噻吩(KF)、氯霉素(C)、环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LEV)、庆大霉素(CN)、阿米卡星(AK)、链霉素(S)、呋喃妥因(F)、美罗培南(MEM)、亚胺培南(IPM)、萘啶酸(NA)、四环素(TE)、甲氧苄氨嘧啶(W)、复方新诺明(SXT)。MH琼脂：Oxoid MH琼脂(CLSI标准)Mueller-Hinton Agar CLSI；LB肉汤：北京陆桥技术有限责任公司；SS琼脂培养基：杭州微生物试剂有限公司；NaCl：广东光华化学厂有限公司；电子比浊仪：生物梅里埃VITEK Densichek电子比浊器；比浊仪浊度标准：生物梅里埃DENSICHEK CALIBRATION SHANDARD电子比浊器浊度标准93059；恒温培养箱、恒温振荡培养箱等。

1.2.2 药敏试验 采用WHO推荐的纸片扩散法(KB法)对菌株做22种常用抗生素的耐药试验，结果判断参照Clinical And Laboratory Standards Institute出版的药物敏感试验指南[3]，采用大肠埃希菌国际标准菌株(ATCC 25922)及金黄色葡萄球菌国际标准菌株(ATCC 25923)和铜绿假单胞菌国际标准菌株(ACTT 27853)作质控菌株。⑴将待测菌株从半固体保存管或冻存管中接种至SS平板，(36±1) ℃培养18～24 h，挑取单个新鲜菌落接种于LB琼脂平板，37 ℃培养18～24 h，挑取单个新鲜菌落置4～5 mL LB肉汤中，(36±1) ℃培养5～6 h。⑵用无菌生理盐水或肉汤调整新鲜生长的肉汤悬液的浊度到0.5个麦氏浓度。用无菌棉签蘸取菌液，在管内壁上挤掉多余菌液。用棉签涂布整个M-H培养基表面。反复3次，每次将平板旋转约60°，最后沿平板内壁绕两圈，保证涂均匀。⑶待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片。在菌接种后15 min钟内贴完纸片，贴好纸片要在15 min将平板反转，(36±1) ℃孵育16～18 h后取出，在黑色背景下用游标卡尺测量抑菌圈直径，从平板背面测量最接近整数毫米数并记录。抑菌环边缘以肉眼见不到细菌明显生长为边界，根据抑菌圈大小判为敏感(S)、中介(I)、耐药(R)。

1.3 统计学处理

采用SPSS 21.0软件行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 致泻性大肠埃希菌耐药分布

130株受试 DEC除对美罗培南和亚胺培南不耐药外，其他抗生素均见耐药。其中，DEC对萘啶酸的耐药严重，高达60.00%；其次是四环素和氨苄西林，均为35.38%；甲氧苄啶及复方新诺明，耐药率分别为26.15%和24.62%。DEC对链霉素和头孢噻吩的中介严重，分别为70.76%和40.00%。见表1。

表1 大肠埃希菌抗生素敏感性分布 株(%)

2.2 各毒力基因型的耐药分布情况

130株分离自感染性腹泻检测粪便样品，依照毒力基因分型[4-5]，在受试菌株中，耐药菌株占84.62%，其中2株EHEC型菌株均为不耐药菌株，2株EIEC型菌株有1株耐药，EAEAC、ETEC、EPEC 3种毒力型的菌株中耐药菌株均超过50.00%。23株EAEC型大肠埃希菌对萘啶酸的耐药率最高，为56.52%，其次是氨苄西林，为52.17%；EPEC型有35株，耐药最高的是氨苄西林，为54.29%，其次是四环素和甲氧苄啶，均为48.57%；ETEC型分离最多株，共68株，对萘啶酸的耐药率最高，达72.46%。这3种毒力基因型对链霉素的中介率均超过50.00%，分别为65.20%、57.14%、73.53%。此外，EHEC和EIEC均只分离出2株，EHEC 2株均不耐药，EIEC有1株耐药，耐药谱为氯霉素+庆大霉素+链霉素+四环素+甲氧苄啶+复方新诺明，且2种毒力型均对链霉素产生中介。

2.3 致泻性大肠埃希菌多重耐药情况

有61株出现2种及以上抗生素耐药，占总株数的46.92%。耐1种抗生素的大肠埃希菌，主要为萘啶酸或四环素耐药。耐2种及以上抗生素的耐药谱中，氨苄西林+萘啶酸+甲氧苄啶+复方新诺明最多，有5株。耐1种抗生素的菌株数量最多(47株)，其次为耐2种和4种抗生素(13株)。耐3类及以上抗生素的菌株有45株，其中源自腹泻患者的11株，源自健康人的34株。108株大肠埃希菌对22种抗生素可分为50种耐药谱型，以EPEC型大肠埃希菌最为分散，达27种，EAEC型达15种，ETEC型有18种。

由表2可知，EPEC型主要耐药谱型为四环素和氯霉素+链霉素+四环素+甲氧苄啶+复方新诺明；萘啶酸是ETEC型的主要耐药谱型，其次为四环素；EAEC最主要的耐药谱型为萘啶酸和氨苄西林+萘啶酸+甲氧苄氨嘧啶+复方新诺明。源自腹泻患者的菌株耐药谱型以萘啶酸或四环素为主。

表2 3种毒力基因型大肠埃希菌主要耐药谱型分布 (株)

3 讨论

我国监测资料表明，不同地区 DEC检出率与优势种群各不相同，但DEC在腹泻病原菌中所占比例呈上升趋势。我国DEC感染类型主要以EPEC和ETEC为主，本研究共检出5种类型 DEC，其中以EPEC(52.30%)和ETEC(26.92%)为主，这与以往报道相近[6-7]。

本研究通过分析130株分离自感染性腹泻检测粪便样品肛拭子的 DEC，应用22种抗生素对其进行药物敏感性试验，结果显示该地区 DEC对亚胺培南、美罗培南高度敏感(100.0%)，对其他抗菌药物耐药性的强度依次为萘啶酸、四环素、氨苄西林、甲氧苄啶、复方新诺明。本文结果显示， DEC对链霉素和头孢噻吩的中介严重，分别为70.76%和40.00%，因此应重视药敏中介率较高的部分抗菌药物如链霉素、氨苄西林/舒巴坦等的使用。

据资料统计显示，抗生素开发研制速度远落后于细菌产生的速度。临床医师应用抗生素可以结合参考本地区DEC对抗菌药物的敏感性，合理选择和使用抗菌药物，尽量在相关科室的指导下使用抗生素药物，避免造成多重耐药等不良后果。这对延缓细菌耐药性的产生、控制耐药菌株的播散和流行，以及研究和开发新型、稳定、高效的抗生素均具有十分重要的意义，此外，无论是腹泻患者还是健康人，临床用药可以首选单环内酰胺类敏感性高的抗生素，可以减少耐药菌株的发生，有效地降低大肠埃希菌的感染率。