拉布拉多犬与金毛寻回猎犬基因组中与髋关节发育不良相关基因COL6A3、FN1的SNP位点检测*

白 静 马雪娜 陈舒婷 周子娟 王福金 王爱国 王靖宇

(大连医科大学实验动物中心，大连 116044)

王爱国(1970—)，男，教授，研究方向：分子遗传学.E-mail:wangaiguotl@hotmail.com

犬髋关节发育不良(Canine Hip Dysplasia，CHD)是一种受多基因调控的先天性遗传疾病，多见于大型或特大型犬，如拉布拉多犬、金毛寻回猎犬等。患有CHD的犬因关节磨损疼痛而行走困难[1-2]。CHD不能通过药物治疗痊愈，临床手术是唯一有效的治疗途径[1]。但这方面的医疗资源紧缺，手术费用昂贵。因而在育种时期对CHD犬的筛选尤为重要，不仅可减少疼痛犬，也可节省大量的社会资源。其中，采用遗传学基因诊断的方法淘汰具有CHD倾向的繁育犬，是有效避免出现CHD犬的理想方法。

髋关节发育不良的成因尚不明确，目前认为有两种主要原因：关节松弛(包括韧带、肌肉、关节囊)和软骨内成骨障碍，或者这两个过程的综合作用[2-3]。COL6A3基因与FN1基因分别参与了肌肉组织、软骨基质的组成[4-5]，特别是，有报道称COL6A3基因的2个SNP位点(CFA25：51031100，51040259)和FN1基因的1个SNP位点(CFA37：25095511)与CHD显著相关[3, 6-7]。但这两个基因的SNP位点能否成为有效预测髋关节发育不良的实用性遗传学诊断指标，还有待进一步的实验验证。

培育成本高和培训成功率低是导盲犬事业目前面临的两大难题[8-9]，犬只的淘汰主要包括性情和健康两方面原因，而CHD是健康原因中的首要因素。因而筛除有CHD患病倾向的犬对提高导盲犬的培训成功率、降低导盲犬的培育成本具有重要意义。本实验通过对与CHD显著相关的COL6A3和FN1基因上的3个SNP位点的多态性进行检测，验证其能否成为CHD的实用性遗传学诊断指标，以期为导盲犬的选育提供有效的筛选方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：髋关节发育不良(X光片诊断)的拉布拉多犬8只、金毛寻回猎犬5只；健康的拉布拉多犬23只、金毛寻回猎犬7只。部分犬(8只)为全国范围内募集所得，其余犬(37只)均由中国导盲犬大连培训基地提供。

1.1.2主要试剂与仪器：EDTA-K2真空采血管，购于江苏宇力医疗器械有限公司；Blood Extraction Kit试剂盒，购于宝生物(大连)生物技术有限公司；主要仪器包括动物X光机(AVChoice 400，代尔公司)，PCR仪(美国Thermo公司)；电泳仪(北京百晶生物技术有限公司)；Gel DocTM EZ成像仪(Bio RAD公司)等。

1.2 方法

1.2.1影像学诊断：采用动物X光机对犬的髋关节进行影像学诊断，髋关节发育不良的发病程度采用 Norberg 角来度量，方法为在一张标准的OFA(Orthopedic Foundation for Animal)片子上，在两股骨头中心作一连线，再由股骨头中心向髋臼前侧缘作直线，这两线夹角为 Norberg 角，Norberg 角的范围一般在 50°～120°之间，大于等于105°被认定为健康犬(图1A所示)，股骨头没有脱节但Norberg角小于等于90°(图1B所示)或股骨头完全脱出髋臼(图1C所示)被认定为重度CHD。

图1 犬髋关节X光影像图注：A：健康犬;B、C：重度髋关节发育不良犬Fig.1 X ray image of the dog hip jointNote：A: normal;B、C: CHD

1.2.2基因组DNA的提取：从犬的前肢静脉采血3～5 mL，置于含EDTA抗凝剂的真空采血管中。采用Blood Extraction Kit试剂盒提取血细胞中的基因组DNA，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.2.3引物设计：依据文献中已报的与犬髋关节发育不良相关的COL6A3和FN1基因的3个SNP位点[3, 6]，在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行基因位点确认，以SNP位点为中心选取DNA序列，应用Primer 3.0软件(http://primer3.ut.ee/)进行引物设计，并对设计的引物进行PCR验证和条件优化。基因的SNP位点信息及引物序列详见表1。

表1 COL6A3和FN1基因SNP位点的生物学信息及引物序列Table 1 The bioinformation and primer sequencesof SNPs of COL6A3 and FN1 genes

1.2.4测序及SNP位点分型：DNA样本经PCR扩增后，委托宝生物(大连)生物技术有限公司进行测序。通过对测序数据的分析，确认SNP位点的多态性类型(图2)。

图2 COL6A3及FN1基因的SNP位点的测序检测注;A、B、C为COL6A3CFA25∶51040259 SNP位点上的A/A型，A/G型，G/G型；D、E、F为COL6A3CFA25∶51031100 SNP位点上的A/A型，A/G型，G/G型；G、H、I为FN1 CFA37∶25095511 SNP位点上的A/A型，A/T型，T/T型。Fig.2 SNP loci of COL6A3 and FN1analyzed by DNA sequencingNote: A, B, C: COL6A3 CFA25∶51040259 SNP loci; D, E, F: COL6A3 CFA25∶51031100SNP loci;G, H, I: FN1CFA37∶25095511 SNP loci

1.3 统计方法

采用SPSS19.0统计学软件，应用χ2检验对基因的SNP位点多态性与髋关节发育不良进行关联度分析，P<0.05为显著相关。

2 结果

2.1 COL6A3基因的CFA25：51040259 SNP位点的多态性检测及分析

以13只髋关节发育不良犬与30只健康犬为研究对象，对COL6A3基因的CFA25∶51040259位点进行PCR、测序和统计学分析，结果如表2所示：A/A、A/G、G/G型在健康犬和髋关节发育不良犬中所占比例均没有显著差异(P>0.05)。

表2 COL6A3基因的CFA25∶51040259SNP位点的检测及分析Table 2 The detection and analysis ofCOL6A3 CFA25∶51040259 SNP loci

2.2 拉布拉多犬中COL6A3基因的CFA25：51040259 SNP位点的检测及分析

以8只髋关节发育不良的拉布拉多犬与23只健康的拉布拉多犬为研究对象，对COL6A3基因的CFA25：51040259位点进行PCR、测序和统计学分析，结果如表3所示：A/A、A/G、G/G型在健康拉布拉多犬和髋关节发育不良的拉布拉多犬中所占比例均没有显著差异(P>0.05)。但A/A型所占比例呈现出有差异的趋势(P=0.07)。

表3 拉布拉多犬中COL6A3基因的CFA25∶51040259 SNP位点的检测及分析Table 3 The detection and analysis of COL6A3 CFA25∶51040259 SNP loci in the Labrador retriever

2.3 金毛寻回犬中COL6A3基因的CFA25：51040259 SNP位点的检测及分析

以5只髋关节发育不良的金毛寻回猎犬与7只健康的金毛寻回猎犬为研究对象，对COL6A3基因的CFA25：51040259位点进行PCR、测序和统计学分析，结果如表4所示：A/A、A/G、G/G型在健康的金毛寻回猎犬和髋关节发育不良的金毛寻回猎犬中所占比例均没有显著差异(P>0.05)。但G/G型在髋关节发育不良的金毛寻回猎犬中有占主要基因型的趋势(P=0.1)。

表4 金毛寻回猎犬中COL6A3基因的CFA25：51040259SNP位点的检测及分析Table 4 The detection and analysis of COL6A3 CFA25：51040259 SNP loci in the Golden retriever

2.4 COL6A3基因的CFA25：51031100 SNP位点的多态性检测及分析

以14只髋关节发育不良犬与中国导盲犬大连培训基地的21只健康犬为研究对象，对COL6A3基因的CFA25：51031100位点进行PCR、测序和统计学分析，结果如表5所示：A/A、A/G、G/G型在健康犬和髋关节发育不良犬中所占比例均没有显著差异(P>0.05)。

表5 COL6A3基因的CFA25：51031100SNP位点的检测及分析Table 5 The detection and analysis of COL6A3 CFA25：51031100 SNP loci

2.5 FN1基因的CFA37：25095511 SNP位点的多态性检测及分析

以12只髋关节发育不良犬与30只健康犬为研究对象，对 FN1基因的CFA37：25095511位点进行PCR、测序和统计学分析，结果如表6所示：A/A、T/A、T/T型在健康犬和髋关节发育不良犬中所占比例均没有显著差异(P>0.05)。

表6 FN1基因的CFA37：25095511SNP位点的检测及分析Table 6 The detection and analysis of FN1CFA37：25095511 SNP loci

3 讨论

CHD是一种受多基因调控、性状复杂并和多个染色体区域相关联的障碍疾病，其遗传方式尚不明确。目前研究表明，可能有2种遗传体系影响CHD的发生，一是控制髋关节周围关节囊松弛的基因，二是控制髋臼发育不良的多基因系统，或两者的单独或协同作用[10]。其中髋关节松弛具有较高的遗传率[11]，已有研究表明，COL6A3与FN1基因均与髋关节松弛相关[3, 6-7]。

COL6A3基因编码胶原蛋白VI中的α3链，如发生纯合突变将导致胶原蛋白VI的减少，而胶原蛋白是软骨细胞、软骨纤维的主要成分，与关节松弛密切相关[4]。有研究报道其SNP位点(CFA25∶51040259)的A/A型在正常和髋关节发育不良的拉布拉多犬的比例有极显著性差异[12]。但我们的实验结果表明，COL6A3基因的SNP位点CFA25∶51040259及CFA25∶51031100的三种基因型(A/A、A/G、G/G)在健康犬和髋关节发育不良犬中所占比例均没有显著差异(表2，表5)。由于本研究的对象包括拉布拉多犬与金毛寻回猎犬，考虑到可能存在的不同品种犬之间的遗传差异，我们又分别对这两种犬的测序结果进行了单独分析。结果表明，拉布拉多犬与金毛寻回猎犬中患CHD犬的COL6A3基因SNP位点(CFA25∶51040259)的基因型趋向不同，拉布拉多犬趋向于A/A型，而金毛寻回猎犬趋向于G/G型，但并无显著差异(表3，表4)。虽然本研究的样本量相对较少，但也充分说明COL6A3基因的SNP位点CFA25∶51040259及CFA25∶51031100不能作为CHD实用性的诊断指标。

FN1基因与软骨细胞外基质的组分以及软骨基质组织的功能密切相关[5]。有报道表明FN1基因的SNP位点CFA37∶25095511与伯恩山犬、德国牧羊犬的CHD疾病显著相关[6-7]。但本研究结果表明，FN1基因的该SNP位点基因型在健康犬和髋关节发育不良犬中的比例没有显著差异(表6)，并且在拉布拉多犬与金毛寻回猎犬犬种内部的独立分析也不存在显著差异，说明该SNP位点不能作为CHD实用性的诊断指标。

本次研究没有检测出差异的原因主要有以下几点：第一，CHD的致病原因和遗传体系尚未明确，关节松弛与CHD发生的具体联系尚不清楚，导致关节松弛的基因是否直接影响CHD的产生还需更多的实验验证；第二，CHD倾向于多基因遗传调控，COL6A3和FN1基因可能与CHD疾病有关联，但可能不是与CHD显著相关的主效基因，或是这3个SNP位点并不能代表COL6A3及FN1基因的影响作用；第三，本次研究对象的样本量较小，有待扩大样本进行进一步验证。

综上所述，COL6A3和FN1基因的CFA25∶51031100，51040259和CFA37∶25095511 SNP位点均不能作为拉布拉多犬与金毛寻回猎犬髋关节发育不良的实用性遗传学诊断指标。我们将继续检测其他与CHD相关候选基因的可能性遗传标记，以期为拉布拉多犬与金毛寻回猎犬幼犬的选育探寻有效的CHD遗传学诊断方法。