卵细胞体外成熟(IVM)在小鼠生物净化中的应用*

杜江涛 武晓静 戴方伟 卢领群 周莎桑 应华忠 郭红刚

(1.浙江省医学科学院浙江省实验动物中心，杭州 310013)(2.杭州市中医院，杭州 310007)

随着生命科学和医学研究的不断深入，越来越多的转基因小鼠应用到科学研究中。而在转基因小鼠制备、饲养、运输及品系共享等过程中，极易造成病原微生物的感染，生物净化是目前去除病原微生物感染的有效途径[1]。

生物净化主要有剖宫取胎和体外受精-胚胎移植两种方法。剖宫取胎操作相对简单，但存在净化不彻底和难以计算最佳剖宫时间等弊端；而体外受精-胚胎移植则需要掌握扎实的胚胎移植技术[2]。

体外受精-胚胎移植法在实际应用中需要大量的成熟卵子，但在超排过程中，由于小鼠年龄、品系、激素用量等许多因素的影响，常常会出现超排失败或只有少量成熟卵子排出的现象，造成净化失败。这对于转基因小鼠，特别是一些珍稀转基因品系来说，是一种巨大的资源浪费。本文旨在利用卵母细胞体外成熟技术(invitromaturation,IVM)，深度挖掘未排卵小鼠卵巢内未成熟卵的发育潜力，以提高珍稀转基因小鼠的卵子利用率，同时也作为常规促排卵失败的一种补救措施。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

实体显微镜(LEICA,S8AP0)；二氧化碳培养箱(Thermo)；超净工作台(苏州佳宝净化工程设备有限公司)。

α-MEM基础培养液(M4526，Sigma)；胎牛血清(22011-8612，浙江天杭生物科技股份有限公司)；丙酮酸钠(P4562，Sigma)；M2培养液(M1250，南京爱贝生物科技有限公司)；获能液/体外受精液(MR-070-D，Millipore)；胚胎发育液(MR-121，Millipore)；PMSG(160926)和HCG(160820)均购自宁波第二激素厂。

1.2 实验动物

待净化转基因小鼠，雌鼠4～6周龄，雄鼠8周龄，来源于科研用小鼠。

清洁级ICR小鼠，雌鼠4～6周龄，雄鼠6～8周龄。来源于上海斯莱克实验动物公司，使用许可证号：SCXK(沪)2017-0005。

以上动物均饲养于浙江省医学科学院实验动物中心屏障系统隔离包内，动物饲养合格证号：SYXK(浙)2014-0008。自由采食饮水，光照12 h/d(7:00-19:00)。

1.3 结扎公鼠的制备

6～8周龄ICR雄鼠，1%戊巴比妥钠麻醉后切开下腹部皮肤和肌肉，暴露两侧输精管，无菌弯镊在酒精灯火焰上烧烫后迅速将输精管夹断。将断开的输精管小心放置原位，撒上少许青霉素粉后缝合肌肉皮肤，1个月后使用。

1.4 小鼠超排

实验分组：A组：注射PMSG和HCG后未排卵卵巢，取卵泡内未成熟卵体外培养；B组：只注射PMSG，48 h后取卵泡内未成熟卵体外培养；C组：注射PMSG和HCG后，输卵管内取成熟卵(正常超排组)直接进行体外受精；D组：注射PMSG和HCG后未排卵卵巢，取卵泡内裸卵和疑似成熟卵体外培养。下文均简称A组、B组、C组和D组。

下午5点，小鼠4周龄5 IU/只，5～6周龄7.5 IU/只，腹腔注射PMSG，48 h后注射相同剂量HCG，16～18 h后收集成熟卵母细胞、未成熟卵母细胞、裸卵和疑似成熟卵。只注射PMSG组则在注射PMSG 46～48 h后取未成熟卵，体外成熟培养16～18 h后进行体外受精与体外胚胎培养(具体方法详见1.6)。

1.5 培养基准备

体外成熟培养液按参考文献配制，主要成分为：α-MEM基础培养液，5%胎牛血清(FBS)，3ng/mL EGF，50mIU/mL rhFSH，0.25 mmol/L丙酮酸钠，青霉素与链霉素各0.5%[3]，0.2 μm滤膜过滤后分装冷冻备用。

采卵前一天，用直径35 mm培养皿分别做IVM液、获能液/受精液、KSOM培养液等液滴，上覆石蜡油，37 ℃、5% CO2培养箱内过夜孵育。

1.6 精子获能、体外受精与未成熟卵IVM

1.6.1精子获能：采卵前1 h，颈椎脱臼处死雄鼠，在1∶200稀释万洁消毒液中浸泡消毒，置于干净卫生纸上吸干液体。无菌手术器械取其两侧附睾尾，剔除多余脂肪组织，在无菌滤纸上来回滚动数次除去血渍，放入提前过夜孵育的获能皿的石蜡油中。用无菌镊夹住附睾尾使其绷紧，并用1 mL无菌注射器针头刺破附睾尾，将溢出的精液移到获能液滴中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中获能1 h。

1.6.2体外受精：净化用转基因雌鼠，HCG注射16～18 h后，颈椎脱臼处死，1∶200稀释万洁消毒液中浸泡消毒，取其两侧卵巢和输卵管，将其置于提前预热至37 ℃的M2培养液中。M2培养液中再次清洗后，放在无菌滤纸上吸干液体，然后转到提前过夜孵育的受精液滴皿的石蜡油中。靠近受精液滴，找到输卵管膨大部，用1 mL无菌注射器划破膨大部，将卵子移到受精液滴中。未见膨大部的卵巢则置于M2培养液中，37 ℃保温备用。

取在培养箱中获能1 h的获能液滴皿，显微镜下检查精子活力和精子数量。用移液器吸取获能液滴周边精子10 μL(约含精子200个/μL)，加入到已移入卵子的受精液滴中(50～100个)。37 ℃、5% CO2培养箱中受精4 h，然后将所有卵子转至胚胎发育液KSOM中。

1.6.3未成熟卵IVM：取M2中保存的未超排卵巢，实体显微镜下用镊子将卵巢周边的脂肪及输卵管剥离干净，M2中清洗2～3次后，转入事先37 ℃预热的α-MEM中。用1 mL注射器针头划破卵泡，释放卵丘卵母细胞复合体(COCs)。无菌玻璃管在酒精灯火焰上烤热熔化后迅速拉至直径比COCs稍粗的玻璃针(提前准备)，用口吸管吸取至少有3层颗粒细胞包裹的COCs，转至另一皿干净的α-MEM中。捡卵结束后将所有的COCs转至事先在37 ℃、5% CO2培养箱过夜孵育的IVM液滴中，清洗2～3次后转至200 μL大液滴，37 ℃、5% CO2培养箱内培养16～18 h，然后进行体外受精。精子获能、体外受精方法同上。体外受精4 h后转至胚胎发育液KSOM中。

取注射PMSG和HCG后未排卵卵巢卵泡内的裸卵和疑似成熟卵(卵丘颗粒细胞已扩散)，分为三组进行实验：直接受精；体外成熟培养6 h后受精和体外成熟培养16～18 h后受精。受精4 h后转至胚胎发育液KSOM中。

1.7 受体小鼠的挑选、合笼与胚胎移植

体外受精当天下午5点左右，挑取阴门红肿发情的ICR雌鼠，与结扎雄鼠1∶1合笼交配。于次日早上挑取有阴栓的小鼠(即受体小鼠)，无菌环境下从隔离包转至超净工作台。

受体小鼠1%戊巴比妥钠麻醉，背部剃毛，75%酒精，碘酊再75%酒精消毒。在卵巢位置剪一纵向小口，依次剪开皮肤、肌肉、腹膜后，用镊子找到脂肪垫，将其和卵巢、输卵管一起拉出。用脂肪夹夹住脂肪垫，固定好卵巢和输卵管，在显微镜下找到输卵管膨大部并将其调整至最高位。玻璃针最前端吸取3个气泡，然后吸取20～30个2-细胞胚，在输卵管膨大部前端进针，将2-细胞胚吹至膨大部。当三个气泡均吹至膨大部时，说明全部2-细胞胚已经移植到输卵管膨大部内。

2 结果

2.1 A组和B组与C组卵细胞体外成熟率、二胞率、囊胚率及出生率

注射PMSG和HCG后，未排卵卵巢(A组)，取卵泡内未成熟卵体外培养，3次重复实验，其成熟率为：88.6%(62/70)，83.3%(45/54)，89.2%(66/74)。二胞率为：67.1%(47/70)，42.6%(23/54)，55.4%(41/74)。13枚二细胞胚胎体外发育，有3枚发育至囊胚，囊胚发育率为23.1%(3/13)。将41枚二细胞胚胎移植到2只受体鼠体内，其中1只生出5只幼崽，产仔率为12.2%(5/41)。

只注射PMSG，48 h后取卵泡内未成熟卵(B组)，4次体外成熟培养，其成熟率为：79.3%(65/82)，88.1%(140/159)，82.4%(131/159)，86.0%(92/107)。二胞率为：59.8%(49/82)，44.0%(70/159)，43.4%(69/159)，59.8%(64/107)。囊胚率为：36.7(18/49)，58.6(41/70)，30.4(21/69)，28.1(18/64)。

注射PMSG和HCG后，输卵管内取成熟卵(C组)，直接进行体外受精，受精后二胞率为：79.5%(167/210)，79.0%(233/295)，78.3%(195/249)。囊胚率为：73.7%(123/167)，79.8%(186/233)，80.5%(157/195)。见表1。

A组与B组相比，其成熟率和二胞率均无显著性差异(P>0.05)。A组二胞率与C组相比，有显著性差异(P<0.05)。B组二胞率与C组相比，有极显著性差异(P<0.01)。A组和B组与C组相比，囊胚率均有极显著性差异(P<0.01)。

表1 A组、B组和C组卵细胞体外发育结果Table 1 Oocytes in vitro development results of group A,B and C.

2.2 D组不同成熟培养时间卵细胞体外成熟率、二胞率及囊胚率

注射PMSG和HCG后未排卵的卵巢，取卵泡内裸卵和疑似成熟卵(D组)，体外成熟培养时间分为三组：成熟培养0 h(即直接进行体外受精)；成熟培养6 h和成熟培养16～18 h。受精后成熟培养0 h两次重复实验二胞率为10.2%、15.6%，囊胚率为0.0%、22.7%；成熟培养6 h二胞率为5.7%，囊胚率为0.0%；成熟培养16～18 h两次重复实验二胞率为1.3%、18.6%，囊胚率为0.0%、3.3%。(详见表2)。

表2 D组卵细胞体外发育结果Table 2 Oocytes in vitro development results of group D

D组中体外成熟培养0 h、6h和16～18 h，其二胞率和囊胚率与组A、B、C相比均有极显著性差异。

3 讨论

3.1 超数排卵

通过超数排卵获得大量整齐优质的卵子是生物净化、转基因、克隆等研究的基础之一。影响超排的因素有很多，如：供体雌鼠的品系、年龄与体质量、激素的注射剂量和注射时间、环境因素(温度、湿度和噪声)等[4]。

我们在试验中，对不同品系小鼠一律采用：3～4周腹腔注射5 IU PMSG和HCG；5～6周注射7.5 IU PMSG和HCG；而对7周及以上则注射10 IU PMSG和HCG，两种激素注射间隔时间均为48 h。结果表明，C57BL/6 J小鼠超排效果最好且稳定。宋绍征等[5]研究发现在相同剂量激素条件下，ICR小鼠和C57BL/6 J小鼠的超排效果显著优于BALB/c小鼠和FVB小鼠，我们试验结果与其相一致，原因可能是近交系的遗传因素导致BALB/c、FVB、129等小鼠的繁殖能力较差。

3～4周小鼠相较于其它周龄小鼠，可获得最好的超排效果，这与徐平[6]的研究结果相一致，这可能是性成熟后的小鼠固有的性周期和性激素对外源性的超排激素(PMSG和HCG)有影响。

关于小鼠超排最合适的激素用量，目前国外多采用eCG/PMSG和HCG各5IU或各7.5IU剂量[3, 7-9]，国内有的采用PMSG和HCG各5IU或各10IU剂量。而我们在试验过程中，则根据小鼠年龄体质量的不同做了适当调整。

年龄较大雌鼠和一些近交系小鼠(BALB/c、FVB、129等)的超排效果一直较差，甚至无排卵，正是这些问题的存在，迫使我们寻找一种新的方法来提高卵子利用率，卵母细胞体外成熟则为解决这一问题提供了新的途径。

3.2 卵母细胞体外成熟

卵母细胞体外成熟(invitromaturation,IVM)是一项重要的辅助生殖技术和研究工具。因其可以生产成熟卵子被广泛应用于各研究领域，如：人类不孕症治疗、家畜人工育种中的胚胎生产、克隆、干细胞和转基因技术等[9]。

小鼠卵母细胞体外成熟一般是在注射eCG/PMSG 44或48 h后直接从卵泡中取未成熟卵体外培养[10-12]，而我们在生物净化中则是针对注射PMSG和HCG后未排卵的卵巢。为了比较注射HCG对卵巢卵泡内未成熟卵体外发育的影响，我们设置了两组试验：注射PMSG和HCG后未排卵组(A组)和只注射PMSG，48 h后取未成熟卵组(B组)，同时以注射PMSG和HCG后正常超排卵组(C组)作为对照。结果发现：注射HCG对卵泡内未成熟卵体外成熟、体外受精、体外胚胎发育等并无影响，A组与B组的成熟率、二胞率均无显著性差异(P>0.05)。因A组体外受精后大部分二细胞胚胎用于移植，只有很少一部分(13枚)用来做体外胚胎发育，所以A组与B组的囊胚率并无可比性。A组的二细胞胚胎做了3次移植试验，分别移植34、23和41枚二细胞胚，但因受体等各种因素的影响，只成功了一次。41枚二细胞胚移植到两只受体小鼠输卵管内，其中一只成功受孕生出5只小鼠(2雄3雌)，5只小鼠性成熟后相互交配可产下正常的后代，说明通过IVM技术出生的小鼠是健康可育的[13]。

但是，注射HCG可导致超排后的卵巢质地松软，卵巢表面缺少较好的卵泡，卵泡内部大部分为裸卵或卵丘颗粒细胞已经扩散的卵(疑似成熟卵)。与只注射PMSG相比，注射HCG后获得的质量较好的卵丘卵母细胞复合物(COCs，至少有三层颗粒细胞包裹)大大减少。但是只要有颗粒细胞包裹的COCs，在体外成熟培养16～18 h后，颗粒细胞均会扩散，经体外受精后大部分可卵裂至二细胞胚胎，其成熟率和受精率均较理想。

A组、B组与正常超排卵对照组(C组)相比，卵细胞成熟率、二胞率和囊胚率均有显著性差异，说明在现有的技术条件下，卵细胞体外成熟仍不能完全模拟其体内发育环境和条件，对卵细胞成熟的机理有待进一步研究。

PMSG和HCG注射后未排卵卵巢，卵泡内有大量裸卵和疑似成熟卵(卵丘颗粒细胞已扩散卵)，为了进一步挖掘这部分卵子的利用价值，我们分三组进行试验：体外成熟培养0 h(直接进行体外受精)、体外成熟培养6 h后体外受精和体外成熟培养16～18 h后体外受精。直接进行体外受精组，两次重复实验，受精后二胞率分别为15.6%(22/141)和10.2(5/49)，囊胚率分别为22.7%(5/22)和0%(0/5)。说明在这些裸卵和疑似成熟卵中，有真正的成熟卵，但只是占很少一部分比例。体外成熟培养6 h组二胞率为5.7%(3/53)，囊胚率为0%(0/3)；体外成熟培养16～18 h组，两次重复实验，二胞率分别为18.6%(30/161)和1.3%(1/79)，囊胚率分别为3.3%(1/30)和0%(0/1)。说明在这些裸卵和疑似成熟卵中，只有很少一部分可以在体外成熟培养后获得受精能力。不管是直接进行体外受精，还是体外成熟培养6 h、16～18 h后进行体外受精，裸卵和疑似成熟卵受精后的二胞率、囊胚率都不尽如人意。分析其原因可能是这部分卵子，由于没有卵丘颗粒细胞的包裹，所以在体外成熟培养中不能很好地接受成熟因子的调控[8]。然而，只注射PMSG(B组)的卵泡中，大部分是有颗粒细胞包裹的未成熟卵，裸卵只有很少一部分，并且未见到有疑似成熟卵。由此得出结论：注射PMSG和HCG后未排卵卵巢卵泡内大量的裸卵和疑似成熟卵是HCG作用的结果，至于为什么没有排出原因尚不清楚。

综上所述，卵母细胞体外成熟(IVM)可以作为生物净化中小鼠促排卵失败的一种补救措施，并且可以提高一些珍稀转基因品系小鼠的卵子利用率。