应用微卫星DNA标记对广西食蟹猴的遗传学研究*

张洁宏 覃辉艳 李 彬 杨 慧 王 芳 陈华凤

(广西壮族自治区疾病预防控制中心，南宁 530028)

食蟹猴又称长尾猴，属于猴科，猕猴亚科，猕猴属，食蟹猴种，因其喜欢在退潮后到海边觅食螃蟹及贝类而得名，主要分布在亚洲东南部老挝、越南、印度尼西亚、马来西亚等国家地区，国内主要为人工饲养种群。因其体型较小，适应性强，容易驯养繁殖，在生物进化上与人类的遗传物质有98.5%的同源性，组织结构，生理代谢等与人类较接近，在生物学、心理学、医学等多种生命科学研究中有着其他实验动物无法替代的重要地位[1]。特别是在心脑血管疾病、神经系统疾病、生殖系统疾病、内分泌系统疾病、艾滋病、结核等恶性传染病、器官移植等研究中食蟹猴有着极高的应用价值[2-3]。目前，食蟹猴已成为生命科学研究最常用的大型实验动物之一，我国也是全世界作为实验动物使用和出口食蟹猴最多的国家，检测食蟹猴遗传质量，建立遗传背景清楚的食蟹猴种群，提供标准化的实验食蟹猴，将有力保障研究结果的准确性、科学性和有效性。但目前我国食蟹猴遗传背景研究较少。因此，本研究应用20个微卫星位点对广西食蟹猴进行遗传检测，探讨广西食蟹猴的遗传背景，并为建立广西食蟹猴遗传质量检测方法和种群资源库提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取广西3家最大最具有代表性的食蟹猴养殖公司(以下分别简称为F、N和W)进行无关个体随机采样，共采样成年食蟹猴30只，每个公司各10只，雌雄各半，年龄为3～4岁，体质量为3～4 kg，F、N和W 3家食蟹猴养殖公司目前的种猴数量均为4千只左右，总存栏猴数量均为1～1.2万只，为避免选择的个体相互间存在父子、母子、同胞关系，本研究根据养殖公司给定的记录谱系，从育成待发猴群的不同栏舍进行无关个体随机抽样，空腹自上肢静脉抽取全血2 mL，EDTA抗凝。

1.2 主要仪器与试剂

仪器：Sigma高速冷冻离心机、Bio-Rad电泳仪、UVP GelDoc-It2凝胶成像分析仪、ABI梯度PCR仪、ABI 3730XL测序仪等。

试剂：Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit核酸提取试剂盒、Takara Premix Ex TaqTMHot Start Version PCR反应试剂盒等。

1.3 实验方法

1.3.1核酸样品制备：全血样品使用Qiagen公司货号为69504的试剂盒DNeasy Blood & Tissue Kit(50)提取核酸。核酸提取后采用ND-1000 紫外分光光度计分析提取核酸的纯度和浓度。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品是否含有主带。

1.3.2微卫星位点选取与引物合成：根据文献[1，4-8]和GenBank数据库提供的信息，选择等位基因数、多态性含量丰富、尽可能分布于多条不同染色体的20个微卫星位点，其中位点D1S533、D10S611、D2S146、D3S1768、D3S3045、D4S1645、D5S1466、D6S311、D8S1106、D9S934、D11S1352、D12S67、D13S797、D15S644、D18S536、DXS6810选取于文献1～6，位点D12S375、D16S409、D17S800、D22S419选取于GenBank数据库。20个微卫星位点序列均在GenBank数据库查找。各位点引物使用FAM标记，由华大基因合成。引物编号和序列见表1。

1.3.3PCR反应：PCR反应体系为：Premix Ex Taq Hot Start Version 10 μL、模板1 μL、10 μmol/L正向引物0.5 μL、10 μmol/L反向引物0.5 μL、无酶水补足至20 μL。扩增程序为：94 ℃预变性3 min、94 ℃变性30 s，最佳退火温度(见表1)30 s，72 ℃延伸30 s，循环30次，72 ℃保持10 min。

1.3.5毛细管电泳：将甲酰胺与分子量内标按100∶1 的体积比混匀后，取9 μL加入上样板中，再加入1 μL稀释10 倍的PCR产物，使用ABI 3730XL 测序仪进行毛细管电泳。利用Genemarker 中的Fragment(Plant)片段分析软件对测序仪得到的原始数据进行分析，将各泳道内分子量内标的位置与各样品峰值的位置做比较分析，得到片段大小。

表1 20 个食蟹猴微卫星位点的扩增条件和染色体分布Table 1 Amplifying condition and chromosomedistribution of 20 microsatellite DNAloci in Macaca fascicularis

1.4 统计方法

采用POPGENE32和NTSYS软件对样品进行遗传多样性分析。计算各引物的等位基因数、有效等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、香隆信息指数、Nei’s基因多样度以及多态信息含量等群体内的遗传变异和遗传距离、遗传相似系数、F-统计量、基因流等群体间遗传关系。

2 结果

2.1 20个微卫星位点片段大小

30个样品20个检测位点毛细管电泳片段大小范围见表2。

2.2 群体遗传多态性分析

由表3可见，30个样本共检测到等位基因237个，其观察等位基因数Na为5～19个，平均为11.85个，其中最多的位点是D12S67，高达19个，最少的位点是D18S536，有5个等位基因。有效等位基因数Ne为3.2374～12.3288个，平均为6.9473个；观察杂合度Ho为0.3～1，平均为0.7833，期望杂合度He为0.8508～0.9345，平均为0.85，平均期望杂合度He 略高于平均观察杂合度Ho；Nei’s基因多样度H为0.6911～0.9189，平均为0.8358；香隆信息指数I为1.3914～2.7085，平均为2.0954；多态信息含量PIC为0.6609～0.9135，平均为0.817，均大于0.5；表明广西食蟹猴总群体在微卫星水平上表现出较高的遗传多态性。分别对3个群体进行遗传多态性分析(见表4)，3个群体(F、N和W)分别检测到等位基因158、158和173个，平均期望杂合度He分别为0.8371、0.8318和0.8642；平均多态信息含量PIC分别为0.7692、0.7653和0.8001，3个群体亦存在较高的遗传多态性。

表2 20个微卫星DNA检测位点片段大小Table 2 DNA fragment size of 20 microsatellite DNA loci

表3 30个样品20个微卫星位点遗传多态性检测结果Table 3 Genetic polymorphism measured at 20 microsatellite loci in 30 samples

表4 3个群体遗传多态性检测结果Table 4 Genetic polymorphism in 3 groups

2.3 Hardy-Weinberg平衡检测

Hardy-Weinberg平衡检测结果表明(见表5)，多数位点处于H-W平衡，只有F群体在位点D6S311、DXS6810上，N群体在位点D13S797、DXS6810上，W群体在位点D1S533、D9S934、D22S419上存在不平衡，P<0.05。

表5 Hardy-Weinberg平衡检测结果Table 5 Result of Hardy-Weinberg equilibrium

2.4 遗传距离和遗传相似系数

表6星号上方是遗传相似系数，下方是遗传距离。由表6可见，3个群体遗传距离变化范围为0.2556～0.3223，遗传相似度范围为72.45%～77.45%。

表6 Nei’s遗传距离和遗传相似系数检测结果Table 6 Nei’s unbiased measures of geneticdistance and genetic identity

2.5 聚类分析

利用Nei’s遗传距离进行UPGMA聚类分析，得到2大类，结果见图1。F群体和N群体先聚为一类，再和W群体聚为一类。

图1 基于Nei’s遗传距离的UPGMA聚类图Fig.1 UPGMA dendrogram based onNei’s genetic distance

2.6 F-统计量和基因流

由表7可见，Fis均值为0.0235，Fit均值为0.0628，表明群体受近亲交配和人工选择影响小。Fst均值为0.0402，Nm均值为5.9616，表明群体间遗传分化小。

表7 F-统计量和基因流检测结果Table 7 Result of F-statistics and gene flow

3 讨论

实验动物遗传质量检测是评价实验动物质量的一个重要手段，其目的是为了确定被检动物是否符合该品系或种群的生物学特性以及检测该种群动物的近交程度等。随着生物技术的发展，现遗传标记研究主要集中在DNA分子水平上。微卫星是由2～6个核苷酸的串联重复片段构成的DNA序列，因其具有分布广泛、多态性丰富、易于检测、结果稳定可靠等特点，现已被广泛应用于亲缘关系鉴定、人类疾病诊断、实验动物遗传质量检测、生物群体遗传多样性遗传结构与物种资源保护等多领域[9]。2007年Kikuchi 等[10]从人类基因库中选取148个微卫星位点首次研究报道了食蟹猴的微卫星标记。近年来，Nikzad等[11]应用18个微卫星位点评估了马来西亚6个岛屿野生食蟹猴的遗传多样性和种群结构，结果显示总群体平均观察杂合度为0.497，平均期望杂合度为0.803，Sunggala和Penang岛食蟹猴群体具有较高的遗传多样性，马来西亚食蟹猴遗传距离和地理位置之间没有较大关联。Smith等[12]应用15个微卫星位点比较分析了菲律宾食蟹猴与印度尼西亚、新加坡、毛里求斯、柬埔寨食蟹猴的遗传特性，菲律宾、毛里求斯食蟹猴遗传多样性较印度尼西亚、新加坡和柬埔寨低，群体间存在较大遗传分化。国内李瑞生等[1]、刘欢[8]分别应用20个微卫星位点、18个微卫星位点有效分析了国内食蟹猴群体的遗传多样性，国内饲养食蟹猴的遗传多样性较高于东南亚地区。

本研究采用20个微卫星位点探讨广西食蟹猴的遗传质量，多个基因位点的遗传参数平均值是衡量群体遗传变异大小和群体遗传多样性常用的指标，其中多态信息含量PIC是反应微卫星位点多态性的理想指标，当PIC>0.5时，微卫星位点具有高度多态性。杂合度是衡量群体内遗传变异最直接和最有效的指标，其值越高群体的遗传多样性越丰富[13]。本研究结果显示20个微卫星多态信息含量PIC均大于0.5，为0.6609～0.9135，平均为0.817，表明20个微卫星位点均为高多态性位点，能较好地反应广西食蟹猴的遗传多样性，与文献[1,4-8]报道的微卫星位点多态性相同。30个样品20个微卫星位点观察等位基因数Na为5～19个，平均观察等位基因数Na为11.85个，平均有效等位基因数Ne为6.9473个，亦与文献[1,4-8]检测到的观察等位基因数大致相同。总群体平均观察杂合度Ho为0.7833，平均期望杂合度He为0.85，且Nei’s基因多样度H和香隆信息指数I均较高，表明广西食蟹猴猴群等位基因数多、杂合度大，遗传多样性丰富。分别对3个生产群(F、N和W)进行遗传多态性分析，3个生产群杂合度H、多态信息含量PIC、Nei’s基因多样度H和香隆信息指数I均较高，表明3个生产群亦存在较高的遗传多态性。3个群体平均观察杂合度接近平均期望杂合度，Hardy—Weinberg平衡检测每个生产群在2～3个位点处于不平衡外，多数位点处于H-W平衡， F—统计量Fis均值和Fit均值均较低，表明各群体受人工选择和近亲交配影响小，基本处于随机交配状态，3家养殖公司开展的遗传繁育方式较合理。种群的基因多样性与群体来源的复杂程度、群体大小及繁育方式有着直接的关联，广西F、N和W 3家食蟹猴养殖公司食蟹猴基本以来源于越南、柬埔寨、缅甸和老挝等多个国家的野生群体为主，经过多次引种和本场育种形成，引种来源覆盖面广，且时间跨度大，存栏数量大，开展的遗传繁育方式较合理，故本次检测广西食蟹猴杂合度较高。皮道元等[14]采用11个微卫星位点分析了广西引种回来的柬埔寨、越南和老挝食蟹猴群体的遗传多样性，共检测到平均等位基因数Na为11.82个，平均有效等位基因8.15个，总群体期望杂合度为0.8562。刘欢[8]采用18个微卫星位点对我国广东、广西、云南和海南4省饲养的食蟹猴进行遗传多样性分析亦显示，广西群体平均观察杂合度分别为0.6546、0.6299、0.6948，平均期望杂合度分别为0.8390、0.8135、0.8326，与本研究杂合度相似。李瑞生等[1]的研究结果亦表明食蟹猴个体间均呈现高度的多态性，基因多样性为0.7832～0.8801，香隆信息指数为1.5651～2.1592，且雌雄个体间无差异。

对3个生产群的群体间遗传关系分析可见，群体间的遗传分化系数Fst均值为0.0402，依据Wright[15]建议，当Fst在0～0.05之间说明种群间遗传分化很小，0.05～0.15之间中等遗传分化，0.15～0.25之间遗传分化大，大于0.25遗传分化极大。本研究3个生产群间的遗传分化很小，平均95.98%的遗传变异存在于群体之内，只有4.02%的遗传变异存在于群体之间，群体内的遗传变异是主要的变异来源。群体间的遗传分化水平与基因流密切相关，Wright认为若基因流Nm<1，有限的基因流是促使群体发生遗传分化的主要原因，若Nm>1，基因流能防止不同地区亚群体间发生遗传分化[16]。本研究Nm均值为5.9616，群体间基因流动较频繁，可防止群体间产生遗传分化。对3个生产群的遗传距离和亲缘关系分析亦可见，3个群体的遗传距离较小，亲缘关系较近，F群体和N群体遗传距离最近，为0.2556，遗传相似度最高，达77.45%，N群体和W群体的遗传距离最远，为0.3223，遗传相似度为72.45%。聚类分析也显示，F群体和N群体先聚为一类，再和W群体聚为一类，符合3个繁殖猴场各自关联引种历史特征。刘欢[6]对国内广西等4省笼养的食蟹猴进行遗传多样性研究，结果亦表明广西群体遗传距离为0.2126～0.3571，遗传相似度为69.97%～80.85%，与本研究相似。

本研究运用微卫星DNA标记技术有效分析了广西食蟹猴的遗传多态性和群体间的遗传关系，为今后建立广西食蟹猴遗传背景资源库，指导食蟹猴的生产繁殖，建立遗传背景清楚的食蟹猴种群提供了理论依据。同时也为在广西建立食蟹猴微卫星DNA遗传质量监测奠定了基础。