芍药苷对结肠癌SW480细胞增殖、侵袭、迁移的影响

司晓丽，韩玉梅，王家敏，李兰珍，朱向东*

（1甘肃中医药大学基础医学院，兰州 730000；2兰州大学基础医学院，兰州 730000；3西北民族大学生物医学研究中心 甘肃省动物细胞技术创新中心，兰州730030）

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是常见的恶性肿瘤，5-氟尿嘧啶（5- fluorouracil, 5-FU）是治疗结直肠癌较为有效的化疗药物[1]，但临床应用中产生的耐药性以及副反应[2]促使更为有效、安全的药物的研发。

芍药苷（paeoni florin, PF）是中药芍药根部提取物的主要活性成分。现代药理学研究发现芍药苷具有多种生物学活性，抗炎、抗抑郁、神经保护、免疫调节等药理作用[3-5]。此外，芍药苷对肿瘤细胞的增殖、侵袭具有显著抑制作用。通过下调MMP-9以及ERK蛋白的表达，增加E-cadherin的表达，芍药苷能够抑制肝癌细胞株的侵袭、迁移[6]。同时，芍药苷也能够通过抑制NF-κB的活性，下调MDR1、BCL-XL、BCL-2基因表达，有效的调节胃癌细胞的多药耐药[7]。本研究通过体外培养结肠癌SW480细胞，观察芍药苷对SW480细胞增殖、侵袭以及迁移的影响，探究其可能存在的干预机制。

材料与方法

1 材料与药物

人结肠癌SW480细胞株，复苏自本研究所；芍药苷（麦克林，C10081578）、5-FU（Solarbio,1126A025）

2 主要试剂与仪器

DMEM/F12液体培养基（HyClone,AC10237711），胎牛血清（BI,1729601），青链霉素双抗（HyClone, J170042），0.5%Trypsin-EDTA（gibco,1835027），2.5%结晶紫溶液（Solarbio,G1061），基底胶Matrigel （Solarbio,20180125），CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒（日本同仁化工，LF673），PBS磷酸盐缓冲液干粉（Solarbio, 11310217），4%组织细胞固定液（Solarbio，20180605），BeyoClickT-MEdU-488细胞增殖检测盒（碧云天，C0071S），Triton X-100（Solarbio，104H051）， 鼠 抗 Bcl-2抗体（Immuno Way, YM3041），兔抗Beclin1抗体（Abcam，3738），羊抗兔IgG抗体（Immuno Way，B0201），羊抗鼠IgG抗体（Immuno Way，B0101），45T培养瓶（康宁），SERIES II WATER JACKET细胞培养箱（Thermo），TD4-II低速自动平衡离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司），HH-S2数显恒温水浴锅（江苏正基仪器有限公司），6、24孔Transwell小室（COSTAR），Benchmark Plus 连续波长酶仪（美国Bio-rad），IX73+DP73生物荧光倒置显微镜（OLYMPUS）。

3 细胞体外培养

37℃水浴锅复苏SW480细胞，弃去冻存液，置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基（含100U/ml青、链霉素）的培养瓶中，37℃、5%CO2的细胞培养箱孵育，2～3d更换培养液，细胞长至80%～90%时使用含EDTA的0.5%Trypsin消化传代。

4 芍药苷对SW480细胞增殖能力的影响

4.1 CCK-8细胞增殖-毒性法检测细胞增殖以及IC50

取对数生长期SW480细胞，细胞计数板计数并将细胞数调整为1×104个/ml接种于96孔板，每孔100μl。37℃、5% CO2的细胞培养箱常规培养24h，更换100μl含有不同药物浓度（芍药苷终浓度分别为 5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml）的DMEM/F12培养基，每个浓度设5个复孔。同时设对照组（不含芍药苷）、空白组（不含细胞和芍药苷）以及阳性对照组（给予1.5μg/ml5-FU）。37℃、5% CO2的细胞培养箱继续常规分别培养24h、48h、72h，加入10μl的CCK-8试剂，37℃、5%CO2的细胞培养箱继续培养4h,于酶标仪490nm检测吸光度（A）值。根据公式计算芍药苷对结肠癌SW480细胞的抑制率并计算IC50：抑制率=[1-（实验孔-空白孔）/（对照孔-空白孔）]×100%，各组重复3次。

4.2 EdU-488细胞增殖检测法

取对数生长期SW480细胞，细胞计数板计数并调整为5×105个/ml接种于6孔板，每孔2ml。37℃、5%CO2的细胞培养箱常规培养24h后设空白组、芍药苷组和5-FU组，加药干预继续孵育48h，吸出部分培养液，加入等体积20μmol/L的EdU工作液继续孵育2h，弃去液体，4%组织细胞固定液室温下固定20min，PBS清洗3次，含0.3%Triton X-100的PBS通透液室温孵育15min，弃去通透液并清洗，根据说明书配制Click反应液，每孔500μl进行点击反应避光室温孵育30min，弃去反应液并清洗，Hoechst33342溶液避光室温孵育10min，清洗后，倒置荧光显微镜进行观察摄片。Hoechst33342最大激发波长346nm，最大发射波长460nm，为蓝色荧光，代表总细胞。EdU-488最大激发波长495nm，最大发射波长519nm，为黄绿色荧光，代表增殖细胞，细胞增殖率（%）=增殖细胞/总细胞。各组重复3次。

5 Transwell小室法检测芍药苷对SW480细胞侵袭能力的影响

取基质胶于4℃冰箱过夜溶化，次日，基质胶与培养液1:8稀释，每上室加40μl，37℃孵箱30min成胶。取对数生长期SW480细胞，计数并用含1%胎牛血清的DMEM/F12培养基将细胞数调整为2×105个/ml接种于上室中，每孔100μl。下室中加入500μl含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基，37℃孵箱培养48h后取出24孔板，弃去培养液，PBS清洗3次，4%组织细胞固定液固定30min，随后风干，0.1%结晶紫染色30min，棉签拭去上室内未侵袭肿瘤细胞以及基质胶，PBS清洗3次，倒置显微镜下随机取5个视野计数侵袭肿瘤细胞数。侵袭抑制率=（1-侵袭细胞数药物组/侵袭细胞数空白组）×100%，各组重复3次。

6 Transwell小室法检测芍药苷对SW480细胞迁移能力的影响

方法同上，上室中不加基质胶，倒置显微镜下随机取5个视野计数迁移肿瘤细胞数。迁移抑制率=（1-迁移细胞数药物组/迁移细胞数空白组）×100%，各组重复3次。

7 Western blot法检测芍药苷对SW480细胞beclin1和Bcl-2水平的影响

取预处理48h的各组细胞，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，加蛋白上样缓冲液使蛋白变性。各组取等量（4μl）蛋白上样，经电泳分离后，PVDF膜300mA恒流转膜，5%脱脂奶粉封闭2h;敷一抗并4℃冰箱过夜，PBST洗膜4次，每次8min；避光敷二抗轻摇2h，PBST洗膜4次，每次8min。曝光后分析条带灰度值，以β-actin为内参计算beclin1、Bcl-2的相对水平，各组重复3次。

8 统计处理

采用SPSS23.0统计软件包进行统计处理，所有指标以均数±标准差表示，组间差异比较采用方差分析，beclin1和Bcl-2蛋白表达的相关性采用Pearson相关分析，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

结 果

1 芍药苷抑制SW480细胞增殖

CCK-8细胞增殖-毒性法检测显示，与对照组相比较，芍药苷呈时间、计量依赖性抑制结肠癌SW480细胞的增殖，抑制率随芍药苷浓度的增大而升高，并呈现线性趋势。浓度160μg/ml作用48h可达半数抑制，80μg/ml作用72h可达半数抑制，因此，取160μg/ml作用48h进行后续实验（表1）。

表1 芍药苷处理对SW480细胞增殖的影响（CCK-8细胞增殖-毒性法检测）Tab.1 Effect of paeoni florin on the proliferation of SW480 cells (CCK-8 cell proliferation - toxicity assay)

EdU-488染色显示，增殖细胞胞质中可见大量黄绿色荧光，对照组细胞增殖率为（84.20±4.42）%；与对照组相比较，160μg/ml芍药苷和1.5μg/ml5-FU分别作用48h后，细胞内荧光减弱，细胞增殖率分别为（58.91±4.99）%、（42.63±2.65）%，细胞增殖率显著下降（图1、表2）。

表2 芍药苷处理对SW480细胞增殖的影响（EdU-488染色法检测）Tab. 2 Effect of paeoni florin on the proliferation of SW480 cells (EdU-488 fluorescence staining )

2 芍药苷抑制SW480细胞侵袭力

与对照组相比较，160μg/ml芍药苷、1.5μg/ml5-FU分别作用48h后，SW480细胞侵袭细胞数显著减少，侵袭抑制率分别为26.50%和31.21%（图2、表3）。

图1 芍药苷对SW480细胞增殖影响的EdU-488染色检测。比例尺，50μmFig.1 EdU-488 staining detection for effect of paeoni florin on proliferation of SW480 cells. Scale bar, 50μm

图2 芍药苷对SW480细胞侵袭力影响的Transwell小室法检测。A，对照组；B，芍药苷组；C、5-FU组；比例尺，50μmFig. 2 Transwell assay detection for the effect of paeoni florin on invasion of SW480 cells. A, control group; B, paeoni florin group; C, 5 - FU group; scale bar, 50μm

3 芍药苷抑制SW480细胞迁移力

与对照组相比较，160μg/ml芍药苷、1.5μg/ml5-FU分别作用48h后，SW480细胞迁移细胞数显著减少，迁移抑制率分别为24.64%和32.47%（图3、表3）。

4 芍药苷对SW480细胞beclin1和Bcl-2水平的影响

Western blot检测显示，与对照组相比较，160μg/ml芍药苷、1.5μg/ml5 -FU分别作用48h后，自噬相关基因beclin1水平显著增加，抗凋亡基因Bcl-2水平显著下降（图4、表4）。Pearson相关分析显示，beclin1和Bcl-2在结肠癌SW480细胞中的水平成负相关（r=-0.774，P＜0.01）。

图3 芍药苷对SW480细胞迁移力影响的Transwell小室法检测。A，对照组；B，芍药苷组；C，5-FU组；比例尺，50μmFig. 3 Transwell assay detection for the effect of paeoni florin on migration of SW480 cells. A, control group; B, paeoni florin group; C, 5 - FU group;scale bar, 50μm

表3 芍药苷对SW480细胞侵袭力和迁移力影响的统计学分析Tab.3 Statistical analysis for the effect of paeoni florin on invasion and migration of the SW480 cells

图4 芍药苷对SW480细胞beclin1和Bcl-2水平影响的Western blot检测Fig.4 Western blotting for the effect of paeoni florin on beclin1 and Bcl-2 expression levels in the SW480 cells

表4 芍药苷对SW480细胞内beclin1和Bcl-2水平影响的统计学分析Tab. 4 Statistical analysis for effect of paeoni florin on beclin1 and Bcl-2 expression levels

讨 论

结直肠癌是全球范围内第三常见也是死亡率第二位的恶性肿瘤[8]，严重影响着人类的生活和健康，随着生活方式和饮食习惯的改变，我国结直肠癌的发病率也在逐年增加。目前，结直肠癌的治疗仍以手术为主，并结合化疗以及中西医结合联合治疗[9]。化疗常被作为晚期CRC首选治疗措施，临床采用5-FU或联合奥沙利铂、伊立替康对于晚期CRC患者的生存率有了显著改善,然而，耐药以及化疗药物对患者机体、精神产生的副反应也影响着治疗效果[10]。因此，越来越多毒性小、副作用低、具有良好抗肿瘤作用的中药或提取物得到了广泛的重视。

中药白芍是一种常用的补益药材，具有补血调经、平肝止痛、敛阴止汗等功效，化学成分主要为芍药苷、苯甲酸、黄酮、鞣质、挥发油等[11，12]。陈刚领等研究发现芍药苷能够抑制小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤的生长，肺转移的癌结节数量显著下降[13]。其抑制肿瘤细胞增殖可能通过抑制NF-κB活性,下调抗凋亡蛋白Bcl-2,促进凋亡进而抑制胃癌SGC7901-VCR细胞株的增殖能力[14]。或通过抑制STAT3磷酸化，下调其下游靶点的HIAP、Bcl-2、cyclin D1等蛋白表达促进凋亡，抑制神经胶质瘤细胞的增殖活性[15]。

B细胞淋巴瘤/白血病-2基因（B-cell lymphoma-2，简称Bcl-2）是一类抗凋亡因子，阻止线粒体释放凋亡激活因子以及细胞色素c介导的caspase级联反应，抑制细胞凋亡[16]。同时也是一种癌基因，在乳腺癌、神经胶质瘤等大多数实体肿瘤中存在Bcl-2蛋白过表达，在肿瘤对放化疗的抵抗中起着重要的的作用[17]。体外实验显示Bcl-2过表达可诱导MMP-2mRNA及其蛋白的表达，激活前MMP2蛋白，进而增加肿瘤细胞的侵袭能力以及在体内的肺转移[18]。黄重发等研究显示芍药苷联合奥沙利铂能够显著抑制结肠癌细胞的增殖活性，其机制可能是通过抑制核内NF-κB转录活性，下调Bcl-2表达，促进凋亡进而抑制结肠癌细胞增殖[19]。本实验中芍药苷作用48h后，Bcl-2蛋白的表达较未处理组显著下降，此与上述研究结果一致。但是Western blot结果显示在Bcl-2表达下调的同时，自噬相关基因beclin1蛋白的相对表达量显著增加。

Beclin1广泛表达于人类正常组织中，但在人类乳腺癌、前列腺癌等实体肿瘤中表达下降或缺失[20]，低表达Beclin1的结肠癌细胞中稳定转染beclin1基因后肿瘤细胞生长受到抑制[21]，因此，beclin1也被认为是一种抑癌基因。Beclin1结构中包含与Bcl-2家族相似的BH3结构域，在非饥饿条件下，抗凋亡蛋白Bcl-2通过此BH3结构域与beclin1相结合，影响beclin1/hVps34复合物的形成，抑制自噬[22]。在营养剥夺等条件下，C-Jun氨基末端激酶1（JNK1）可介导细胞内Bcl-2在T69、S70、S87此3个位点发生磷酸化并与Beclin1解离，进而后者诱导自噬发生[23]。Bcl-2与beclin1蛋白的异常表达存在于许多实体肿瘤中。在胰腺癌组织中发现Bcl-2和beclin1的表达呈负相关，研究者认为Bcl-2的过表达，不仅抑制凋亡，同时通过与Beclin1结合，下调Beclin1表达，抑制自噬，两者共同促进胰腺癌的发生发展[24]。在肝癌、乳腺癌等实体肿瘤中同样也存在两者的负相关[25,26]。本研究结果可见，结肠癌SW480细胞低表达beclin1,与Bcl-2存在负相关，芍药苷破坏了Bcl-2与Beclin1的结合，上调beclin1表达，起到抗肿瘤作用。Beclin1与Bcl-2的相互作用暗示自噬与凋亡这两种看似不同的程序性细胞死亡途径在肿瘤发生发展中并非完全独立，本研究仅对芍药苷在结肠癌SW480细胞中对beclin1和Bcl-2两个因子的影响作了初步研究，在此过程中芍药苷对自噬与凋亡的变化以及两者是相互促进，还是相互抑制还有待于进一步深入研究。