骨髓活检组织EBER原位杂交检测影响因素分析

郑捷，方庆全，涂金花

（厦门大学附属第一医院病理科，厦门 361003）

EBV encoded RNA（EBER）是Epstein-Barr virus（EBV，EB病毒）编码的小RNA，该病毒不仅广泛潜伏于健康人群，而且是一些非肿瘤疾病如传染性单核细胞增多症等的病因。更重要的是，EB病毒与越来越多的肿瘤性疾病密切相关[1，2]。EBER原位杂交法因其准确的定位、极高的特异性和灵敏性已成为公认的EB 病毒标准检测方法，并作为病理辅助诊断的重要依据之一在日常工作中应用越来越广泛。由于原位杂交检测步骤多，容易受各种因素（如组织标本的预处理、标本类型、酶的消化程度、杂交后洗涤等）的影响。在临床实际工作中对骨髓活检组织行EBER原位杂交检测时，常因组织脱片或者染色结果不稳定需要进行重复实验。为此，本研究通过实验，从脱钙方法、蛋白酶K消化时间、抗体孵育温度三个影响因素进行优化，摸索较佳的检测条件。

材料与方法

1 标本来源

收集厦门大学附属第一医院病理科2014年5月—2018年5月间确诊为EB病毒相关疾病且标本类型为骨髓活检组织的病例35例。其中NKT细胞淋巴瘤18例，EBV相关淋巴组织增殖性疾病17例。所有标本均经l0%中性福尔马林固定不少于6h。

2 设备与试剂

设备：原位杂交仪为Thermo BriteTM公司S500-24 型；

试剂：原位杂交检测试剂盒购自福建泰普公司。脱钙液的配置：①10%硝酸脱钙液：硝酸10ml加入90 ml蒸馏水；②强酸混合脱钙液配制方法：10%中性福尔马林500ml与95%乙醇500ml混合后，加入甲酸200ml，最后缓慢加入浓盐酸150ml；③ 改良EDTA脱钙液配制方法：250g乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）溶于1350ml磷酸盐缓冲液（PBS），待完全溶解后加入40%甲醛150ml，最后加入适量氢氧化钠（NaOH），将pH值调到7.0左右[3]。

3 方法

3.1 脱钙方法及脱钙终点的判定

将选取的35例标本每例分为三段，分别放入三种不同的脱钙液室温下进行脱钙：A组用10%硝酸脱钙液脱钙1～1.5h后取出流水冲洗30min；B组用强酸混合脱钙液脱钙2-3h后流水冲洗30min；C组用改良EDTA脱钙液脱钙20～24h后流水冲洗30min～1h。骨髓组织浮起，以尖镊探测骨髓活检组织变软或大头针能轻松刺入组织视为脱钙完成[4]。

3.2 不同脱钙液脱钙后的骨髓活检组织行EBER原位杂交检测

①组织脱水与制片：将脱钙完成后的A、B、C三组骨髓活检标本放入自动脱水机中脱水、透明、浸蜡，包埋。制片时将组织粘附于APES处理的防脱载玻片，厚度为3μm，60～70℃烤片1h，脱蜡。②蛋白酶K消化：甩干切片，将组织周围液体用滤纸擦干，滴加蛋白酶K与PBS按1×25比例配制的酶工作液，室温孵育5min，蒸馏水洗1×1min。③杂交:滴加20μl探针/切片，加盖玻片，原位杂交仪55℃变性 60～90min，37℃杂交 4～16h。48℃ PBS 缓冲液浸泡，移去盖玻片后PBS继续浸泡洗涤3×5min。④信号放大和显色: 每张切片分别滴加地高辛染色液试剂A, 37℃孵30min，37℃ PBS浸泡3×2min；试剂B室温孵育30min，PBS浸泡3×2min；试剂C室温30min，PBS浸泡3×2min，DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。比较A、B、C三组的脱片率、切片质量、杂交阳性信号的定位与强度、背景清晰度。

3.3 不同蛋白酶K消化时间的骨髓活检组织行EBER原位杂交检测

将C组用改良EDTA脱钙液脱钙的组织蜡块进行连续切片3片，厚度3μm，随机抽取组成D、E、F四组，分别进行5min、9min、13min间隔4min的梯度消化，其余操作步骤同C组，比较D、E、F三组的脱片率、杂交阳性信号的定位与强度、背景清晰度。

3.4 不同抗体孵育温度下的骨髓活检组织行EBER原位杂交检测

将C组改良EDTA脱钙液脱钙的组织蜡块进行连续切片2片，厚度3μm，蛋白酶K消化9min后，分两组进行对比实验。G组：滴加试剂A置于37℃水浴箱孵育30min，滴加试剂B室温孵育20min，滴加试剂C室温孵育 30min；F组：试剂A孵育30min、试剂B孵育20min、试剂C 孵育30min均在37℃水浴箱中进行，比较G、F两组杂交阳性性号的定位与强度、背景清晰度。

4 EBER原位杂交的判读与染色质量评估标准

细胞核棕黄色为阳性着色，胞浆和胞膜着色不能视为阳性，只有见核分裂时可以出现胞浆阳性着色[5]。设定组织脱片率、切片质量、杂交阳性信号的位置与强度、背景是否清晰有无黄染四项为评价指标，评分标准为：①切片质量（100分）：切片时组织相对较软，基本能完整切片，不影响诊断，减1～10分；切片时感觉较硬，部分有沙粒感，切片不够平整，不影响诊断，减11～30分；切片时刀片磨损严重，肉眼可见明显刀痕，组织皱缩，无法制成完整切片，影响诊断，减31～100分。②杂交阳性信号的定位与强度（100分）：阳性信号定位准确，着色较淡，低倍镜下可分辨，不影响诊断，减1～10分；阳性信号定位较准确，着色低倍镜下不易观察，需转换至高倍镜下仔细辨认，不影响诊断，减11～30分；阳性信号定位不准确，着色太弱，无法准确判读，减31～100分。③背景清晰度（100分）：阳性与阴性细胞对比鲜明，杂交背景轻微黄染，不影响诊断，减1～10分；阳性与阴性细胞对比度不佳，杂交背景出现不同程度黄染，但仍可作出诊断，减11～31分，杂交背景黄染严重，影响诊断，减31～100分。由2名经验丰富的病理医生阅片进行双盲评分，每项指标数据为评分的均值。

5 统计学分析

应用SPSS 22.0 软件进行分析，计数资料采用率的比较，采用χ2检验，计量资料采用均数±标准差(¯x±s)表示，用配对t检验进行两两比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 不同脱钙方式对骨髓活检组织行原位杂交检测的影响

A、B、C三组切片原位杂交染色质量结果比较见表1。比较三组脱片率显示，A组（42.9%）的脱片率明显高于B（14.3%）、C（11.4%）两组的脱片率，差异有统计学意义（P均＜0.01）。用三种脱钙液脱钙的骨髓活检组织基本均能完整切片，A组切片时部分会有沙粒感，肉眼可见明显刀痕，B、C两组切片时组织相对较软，更易切片。杂交阳性信号定位与强度得分C组均显著高于A、B两组，A组原位杂交染色阳性细胞定位较模糊，信号弱甚至不显示，B组阳性细胞定位准确，可是阳性信号的强度不如C组。三组背景染色均较清晰，差异无统计学意义。比较A、B、C三组原位杂交染色质量（图1）可见用改良EDTA脱钙液脱钙的骨髓活检标本行原位杂交染色效果最好。

2 不同蛋白酶K消化时间对骨髓活检组织行原位杂交检测的影响

比较D、E、F三组脱片率，F组（42.9%）明显高于D组（8.6%）和E组（14.3%）（P＜0.01）。D、E、F三组杂交阳性信号的定位与强度得分分别为67.5±2.5、82.5±1.2、81.5±1.0，D 组与 E、F 组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。D、E、F三组背景清晰度指标得分为 84.7±1.2、85.3±1.0、62.1±2.4，F组蛋白酶K消化时间长，背景出现不同程度黄染，与D、E组相比差别有统计学意义（P＜0.01）。比较E、F三组原位杂交染色质量（图2）可见消化时间为9min组的切片，杂交效果最好，阳性细胞着色深，定位准确，背景干净，结果清晰易辨。

图1 不同脱钙方式对骨髓活检组织行原位杂交检测的影响。A，A组组织脱片严重，阳性细胞信号不显示；B，B组组织轻微脱片，阳性信号定位准确，信号较弱；C，C组组织无脱片情况，阳性信号定位准确，阳性信号强；比例尺，50μm。Fig.1 Effect of different decalci fication methods on the in situ hybridization staining in bone marrow biopsy tissues. A, group A had severe tissue detachment from the slide and no positive cell signal was displayed; B, tissue in group B was slightly detached and the positive signal was accurately located but relatively weak; C, there was no detachment in the tissue sections of group C, and the positive signal was accurately located and strong; scale bar, 50μm

3 不同抗体孵育温度对骨髓活检组织行原位杂交检测的影响

G、F组杂交阳性信号定位与强度得分分别为79.3±0.8、89.2±0.5，差异有统计学意义（P＜0.01），背景清晰度得分分别为89.2±0.5、82.2±0.5，差别无统计学意义。因此，试剂A孵育30min、试剂B孵育20min、试剂C 孵育30min均在37℃水浴箱中进行原位杂交检查效果更佳。

表1 不同脱钙方式下的骨髓活检组织原位杂交染色质量评分Tab.1 Quality score of in situ hybridization staining in bone marrow biopsy tissues under different decalci fication methods

图2 不同蛋白酶K消化时间对骨髓活检组织行原位杂交检测的影响。A，E组阳性细胞着色深，背景清晰；B，F组背景出现不同程度黄染；比例尺，5μmFig. 2 Effect of different protease K digestion time on the in situ hybridization staining in bone marrow biopsy tissues. A, the positive cells in group E were deeply stained and accurately positioned with a clear background; B, the background of group F showed different degrees of yellow staining; scale bar, 25μm

讨 论

EBER原位杂交检测是在分子水平上用EBER特有序列设计的单链DNA探针与靶序列按碱基配对原则进行特异性结合,从而检测出EB病毒。骨髓活检组织结构特殊，富含有大量的无机钙盐，骨组织在制片前必须脱钙去除骨中的钙质，脱钙的同时还要尽量减少骨组织结构的损害及核酸分子的丢失，所以脱钙方式至关重要，脱钙液选择不当会对原位杂交的结果产生极大影响。10%硝酸脱钙液是目前作为病理工作中常用的脱钙液，脱钙速度快能力强，但对细胞核和组织结构影响较大，对组织细胞mRNA破坏较大。强酸混合脱钙液的脱钙能力不及硝酸，对于细胞结构的破坏性以及组织细胞mRNA成分的影响小于硝酸脱钙液，但酸类脱钙液均有脱钙程度不易控制的弱点，脱钙不足难以制片，脱钙过度易导致细胞溶解和组织破坏。EDTA是一种优良的钙螯合剂，性质温和，能有效的保存细胞结构。吴鸿雁等[6]通过对比硝酸、EDTA和新型进口脱钙剂Rapidcal三种不同脱钙液在乳腺癌骨转移标本的荧光原位杂交（FISH）检测中的表现中发现，硝酸脱钙液处理后的标本染色效果较差，EDTA脱钙液处理的乳腺癌骨转移标本表现出优秀的标本质量。但EDTA脱钙时间长（4～6周）极大限制了EDTA脱钙剂的临床应用。因此本研究对EDTA脱钙液进行改良，运用了EDTA-2Na并加入40%甲醛固定液，固定脱钙同时进行，原位杂交染色质量得到了明显提高。

除了脱钙方式，酶消化也是原位杂交检测成功与否的关键。蛋白酶K消化组织的目的是去除靶核酸周围的蛋白质，增加组织的通透性，暴露靶基因，利于探针渗透，增强杂交信号强度[7,8]。蛋白酶K消化的关键则是对消化时间的把控。本研究通过对比实验发现，延长蛋白酶K消化时间至9min的骨髓切片原位杂交染色效果最好。

温度是影响抗原抗体结合的重要因素，原则上孵育时间应根据温度的高低进行调整，温度低延长孵育时间，温度高相应缩短孵育时间，但在实际工作中，室温难以调整无法标准化，因此本研究将孵育过程更改成在37℃水浴箱中进行，一定程度上提高了染色效果。

除了骨髓活检标本脱钙方式、酶消化时间、滴加地高辛染液的温度外，技术员还应重视实验操作过程中的细节，以保证检测结果的准确性。例如：①滴加蛋白酶K时应甩干切片，否则蛋白酶被组织上残留的水份稀释，会影响消化的效果；②滴加杂交液后用封片剂进行封边，不但可以防止杂交液挥发也可以节约杂交液的用量；③用免疫组化油笔圈出抗体滴加范围，防止抗体溢到组织边缘，造成“边缘效应”。

综上所述，通过优化骨髓活检组织的脱钙方式，蛋白酶K消化时间，抗体孵育温度可显著降低组织的脱片率，提高EBER原位杂交染色质量，使结果稳定性更好，有助于病理医生更准确地进行EBV相关疾病诊断和鉴别诊断。