不同生长期怀山药化学成分分析

马蕊，杨珂，李文辉，刘玲玲，陈随清

（河南中医药大学药学院，河南郑州450046）

山药为药食同源之品，为薯蓣科植物薯蓣（Dioscorea opposita Thunb.）的根茎[1]。味甘性平，具有补脾养胃、生津益肺、补肾涩精的功效。主要含有淀粉、蛋白质等营养成分及多糖、尿囊素、腺苷、甾醇类[2-4]等多种活性成分，具有调节免疫、抗氧化抗衰老、降糖和调整消化系统等药理作用[5-8]。山药是具有补益作用的上等药材，同时又是具有很高营养价值的食材，凭借着其药食兼用，且平补三焦的特点已经成为全国各地餐桌上的必备美食[9]。

山药主产于河南、山西、河北等地，明、清以来认为“怀庆”者佳，即河南省焦作地区，这也是现代认为的山药道地产区，并将这里产的山药称为“怀山药”，此“怀山药”指现代所说的中药材。怀山药主要栽培品种为怀山药[指植物薯蓣的栽培品种，为了和中药材“怀山药”名称区别，以下统称为怀山药（品种）]和铁棍山药，所以本试验研究材料确定为怀山药（品种）和铁棍山药。

自古药材就有“按时而收”的要求，采收时间直接影响山药的营养价值与药用价值，中药适宜采收期确定的一般原则需要把有效成分的动态积累与药用部分的产量变化等因素结合起来考虑[10]。据文献及产地调查，怀山药采收时间为霜降后地上茎叶枯萎后采收，但是未有确切的数据表明山药化学成分的变化规律，并且有部分商家为了提前出售，会在采收期前进行采挖，影响山药质量。所以本试验采收各个时期的怀山药（品种）和铁棍山药，测定其水溶性浸出物、山药多糖、尿囊素、腺苷、单糖和寡糖等，将怀山药化学成分的积累规律，与药用部位折干率结合，确定最佳采收期，研究其适宜采收期有助于提高山药质量，保证其营养价值，同时为山药规范化种植提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

依据怀山药生长规律，将采样时间定为9月～12月，采样地点为焦作温县、武陟等地，每间隔15 d 左右采样一次。

怀山药（品种）由于含水量大，冬天若没有加工完，在低温环境中易冻坏，农户一般在来年开春进行采收，所以怀山药（品种）采收时期分别为：9月15日、9月28日、10月16日、11月4日、11月16日、12月1日、12月18日、1月3日、1月16日、2月10日、2月27日。平行采样3 批。

铁棍山药采收时期分别为：9月19日、10月2日、10月18日、11月1日、11月15日、12月5日、12月18日。平行采样4 批。

试验所用药材由河南中医药大学药学院陈随清教授鉴定为薯蓣科植物薯蓣（Dioscorea opposita Thunb.）的根茎。

1.2 仪器

UV-2600 紫外分光光度计、LC-20A 高效液相色谱仪：日本岛津公司；ME203E 十万分之一分析天平：梅特勒·托利多仪器（上海）有限公司；BSA124S-CW万分之一天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；Milli-Q Academic A10 超纯水机：美国Millipore 公司。

1.3 试药

尿囊素（批号B20909，质量分数≥98%）、腺苷（批号B21356，质量分数≥98%）、果糖（批号 B21896，质量分数≥99 %）、麦芽糖（批号 B20834，质量分数≥98 %）、蔗糖（批号111507-200302，质量分数≥99%）：上海源叶生物有限公司；葡萄糖（批号110833-200503，质量分数≥98 %）、麦芽三糖（批号100274-200601，含量为100%）：中国食品药品检定研究所；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.4 方法

1.4.1 折干率计算

根据实验室前期试验基础，将鲜山药采挖出来之后除去芦头称重，清洗干净，去皮，切5 mm 厚片，采用热风干燥的方法进行加工，温度开始用80 ℃烘，每隔3h降10℃至50℃，之后每隔1h降10℃至30℃，待山药片完全烘干拿出降至室温后称重计量。

计算公式：折干率/%=干重/鲜重×100

1.4.2 浸出物含量测定

按照2015 版《中国药典》四部（通则2201）项下的冷浸法测定。

1.4.3 山药多糖含量测定

在实验室前期研究基础上[11]，采用紫外分光光度法测定山药多糖的含量。

1.4.4 尿囊素含量测定

1.4.4.1 色谱条件

色谱柱：Xqua C18（250 mm×2.5 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（2∶98）；柱温：30 ℃；流速：0.5 mL/min；检测波长：224 nm；进样体积：10 μL，理论塔板数按尿囊素峰计算不低于5 000。样品和对照品的色谱图见图1。

1.4.4.2 对照品溶液的制备

精密称取尿囊素对照品2.08 mg，至5mL容量瓶中，加50 %甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.416 g/L 的对照品溶液。

图1 山药尿囊素色谱图Fig.1 Allantoin chromatogram of yam

1.4.4.3 供试品溶液制备方法

取山药样品磨成细粉，过三号筛，取粉末1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定重量，超声处理（40 kHz，100 W）30 min，放冷，加 50%甲醇补足减失重量，滤过，取续滤液用0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得。

1.4.4.4 方法学考察

线性关系：精密吸取上述对照品溶液 1、2、5、10、15、20 μL，按 1.4.4.1 色谱条件进样，以峰面积值（Y）对进样量（X）进行线性回归，得回归方程：Y尿囊素=627 915X+26 879（R2=0.998），线性范围为 0.41 μg～8.32 μg，线性关系良好。

精密度：精密吸取上述对照品溶液10 μL，连续进样6 次，测定尿囊素峰面积RSD 为0.84%，表明仪器精密度良好。

重复性：精密称取同一批山药样品粉末6 份，按1.4.4.3 制备供试品溶液，精密吸取 10 μL 按 1.4.4.1 色谱条件进样测定，记录色谱图，按干燥品计算，结果尿囊素平均含量RSD 为2.41%，表明本研究方法重复性良好。

稳定性：吸取同一供试品溶液，分别于 0、2、4、8、12、16、20、24 h 进样，测定峰面积，并计算峰面积 RSD值为1.56%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

回收率：取9 份已知含量的山药样品粉末0.5 g，精密称定，加入浓度为1.34 g/L 尿囊素对照品溶液，制备低、中、高不同浓度的供试品溶液，每一浓度3 份，按1.4.4.3 制备供试品溶液操作，取 10 μL 按 1.4.4.1 色谱条件进行测定，记录峰面积，计算尿囊素平均回收率为98.85%，RSD 为2.92%，结果见表1。

表1 尿囊素回收率试验结果（n=9）Table 1 Results of allantoin recovery test（n=9）

1.4.4.5 样品测定

取不同生长期怀山药样品，按1.4.4.3 供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按1.4.4.1 色谱条件进行测定尿囊素的峰面积以回归方程计算含量。

1.4.5 腺苷含量测定

1.4.5.1 色谱条件

色谱柱为Xqua C18（250 mm×2.5 mm，5 μm）；流动相为甲醇∶水（13∶87）；检测波长为 260 nm；柱温30 ℃；流速 1.0 mL/min；进样量：20 μL。在此色谱条件下，样品中腺苷与其他组分获得了较好的分离，对照品和样品的色谱图见图2。

1.4.5.2 对照品溶液的制备

精密称定腺苷对照品1.95 mg，至50mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，得对照品储备液。精密移取此溶液2mL至5mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，即得对照品溶液。

图2 山药腺苷色谱图Fig.2 Adenosine chromatogram of yam

1.4.5.3 供试品溶液制备方法

取山药样品磨成细粉，过三号筛，取粉末1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定重量，超声处理（40 kHz，100 W）30 min，放冷，加 50%甲醇补足减失重量，滤过，取续滤液用0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得。

1.4.5.4 方法学考察

线性关系：精密吸取上述对照品溶液1、2、5、10、15、20、25、30 μL 按 1.4.5.1 色谱条件进样，以峰面积值（Y）对进样量（X）进行线性回归，得回归方程：Y腺苷=3 323 373X-5 296.11（R2=1），线性范围为 0.015 μg～0.468 μg，线性关系良好。

精密度：精密吸取上述对照品溶液20 μL，连续进样6 次，测定腺苷峰面积RSD 为0.1%，表明仪器精密度良好。

重复性：精密称取同一山药样品粉末6 份，按1.4.5.3 项下制备供试品溶液，精密吸取20 μL 按1.4.5.1 色谱条件进样测定，记录色谱图，按干燥品计算，结果腺苷平均含量RSD 为1.89%，表明本研究方法重复性良好。

稳定性：吸取同一供试品溶液，分别于 0、2、4、8、12、16、20、24 h 进样，测定峰面积，并计算峰面积 RSD值为0.80%，结果腺苷在24 h 内稳定性良好。

回收率：取9 份已知含量的山药片样品粉末0.5 g，精密称定，加入浓度为0.16 g/L 尿囊素对照品溶液，制备低、中、高不同浓度的供试品溶液，每一浓度3 份，按1.4.5.3 制备供试品溶液操作，取 10 μL 按 1.4.5.1 色谱条件进行测定，记录峰面积，计算腺苷平均回收率为96.27%，RSD 为2.17%，结果见表2，表明本研究方法回收率较好。

表2 腺苷回收率试验结果（n=9）Table 2 Results of allantoin recovery test（n=9）

1.4.5.5 样品测定

取不同生长期怀山药样品，按1.4.5.3 供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按1.4.5.1 色谱条件进行测定腺苷的峰面积以回归方程计算含量。

1.4.6 单糖、寡糖含量测定

1.4.6.1 对照品溶液的制备

精密称定果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽三糖对照品 10.05、21.21、10.00、12.09、12.35 mg 至 2mL容量瓶中，加水稀释至刻度，即得浓度分别为5.025、10.605、5.00、6.045、6.175 g/L 的对照品溶液。

1.4.6.2 供试品溶液的制备

将山药样品磨成细粉，过三号筛，取粉末1 g，置具塞锥形瓶中，加15mL水煮沸15 min，冷却至60 ℃以下，加入5mL新鲜配制的2 %淀粉酶溶液55 ℃保温1 h，并时时振摇，然后加一滴碘试液，应不显蓝色，若显蓝色，再加热糊化，并加5mL淀粉酶溶液继续保温，直至碘不显蓝色为止。加热至沸，冷后移入50mL容量瓶中，并加水至刻度，混匀，过滤。取续滤液用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

1.4.6.3 色谱条件

色谱柱Inertsil NH2（5 μm，4.6 mm×250 mm）；检测器为示差检测器；流动相：乙腈-水（80∶20）；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；进样量20 μL。混合对照品及山药样品色谱图见图3。

图3 山药单糖、寡糖色谱图Fig.3 Monosaccharide and oligosaccharide chromatogram of yam

1.4.6.4 方法学考察

线性关系：将果糖、葡萄糖、蔗糖标准溶液稀释，得到果糖不同浓度标准溶液：0.040、0.201、0.500、1.005、2.513、5.025 g/L，葡萄糖不同浓度标准溶液：0.133、0.265、0.530、1.061、2.121、10.605 g/L，蔗糖不同浓度标准溶液：0.125、0.250、0.500、1.000、5.000 g/L，精密吸取上述标准溶液20 μL，按1.4.6.3 色谱条件进样，精密吸取上述麦芽糖和麦芽三糖对照品溶液 2、5、10、20、30、40 μL，按 1.4.6.3 色谱条件进样，以峰面积值（Y）对进样量（X）进行线性回归，分别得五个回归方程：Y果糖=7 984.4X-10 793（R2=0.998） 线性范围为 0.804 μg～100.5 μg；Y葡萄糖=7 232.8X-4 666.5（R2=1），线性范围为2.651 μg ～212.1 μg；Y蔗糖=9 215X-7 893.3（R2=0.998），线性范围为 2.5 μg～100 μg；Y麦芽糖=5 200.6X-9 217.6（R2=0.998），线性范围为 12.09 μg ～241.8 μg；Y麦芽三糖=2 913.7X-15 753（R2=0.998），线性范围为 12.35 μg～247 μg，线性关系均良好。

精密度：精密吸取上述对照品溶液20 μL，连续进样6 次，测定果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽三塘峰面积 RSD 为 0.79 %、0.73 %、0.85 %、0.51 %、0.49 %，表明仪器精密度良好。

重复性：分别精密称取同一山药样品粉末6 份，按1.4.6.2 制备供试品溶液，精密吸取 20 μL 按 1.4.6.3 色谱条件进样测定，记录色谱图，按干燥品计算，结果果糖平均含量RSD 为1.62%，葡萄糖平均含量RSD 为1.95%，蔗糖平均含量RSD 为2.10%，麦芽糖平均含量RSD 为2.34%，麦芽三糖平均含量RSD 为2.27%，表明本研究方法重复性良好。

稳定性：吸取同一供试品溶液，分别于 0、2、4、8、12、16、20、24 h 进样，测定峰面积，测得果糖峰面积RSD 值为1.13%，葡萄糖峰面积RSD 值为1.20%，蔗糖峰面积RSD 值为1.51%，麦芽糖峰面积RSD 值为1.11%，麦芽三糖峰面积RSD 值为1.14%，结果表明果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和麦芽三塘在24 h 内稳定性良好。

回收率：取9 份已知含量的山药样品粉末0.5 g，精密称定，加入不同量的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽三糖对照品，制备低、中、高不同浓度的供试品溶液，每一浓度 3 份，按 1.4.6.2 方法操作，取 20 μL 按按1.4.6.3 色谱条件进行测定，记录峰面积，计算果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽三糖的平均回收率分别为98.79%、101.37%、98.01%、98.52%、100.58%，RSD 分别为2.29%、2.37%、2.87%、2.89%、2.98%，结果表明本研究方法回收率较好。

1.4.6.5 样品测定

取不同生长期怀山药样品，按1.4.6.2 方法操作，取20 μL 按1.4.6.3 色谱条件进行测定，测定果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽三糖的峰面积以回归方程计算样品含量。

2 结果与分析

2.1 折干率

在怀山药不同生长期中，怀山药（品种）从开始采集日期9月15日开始，折干率呈逐渐上升趋势，到12月初趋于最大值，之后的4 次采集呈平稳状态，略有下降，但是次年2月27日最后一次采集的折干率下降了2%，如图4。

图4 怀山药（品种）折干率折线图Fig.4 Line chart of Huai yam drying rate

表明怀山药（品种）9月至12月逐渐生长，养分逐渐增多，折干率增大，12月之后地上茎叶枯萎时，折干率趋于平稳，山药处于休眠状态，到次年2月27日，怀山药（品种）由于在地下保存时间过长，水分养分逐渐消耗，另一方面怀山药（品种）此时根茎开始萌发，会进一步消耗养料，所以折干率大幅下降[12]。

铁棍山药从开始采集日期9月19日开始，折干率呈逐渐上升趋势，到11月中旬达最大值，之后折干率呈相对平稳状态，如图5。

图5 铁棍山药折干率折线图Fig.5 Line chart of Tiegun yam drying rate

表明铁棍山药9月至11月中旬逐渐生长，养分逐渐增多，折干率增大，随后折干率趋于平稳。

2.2 不同生长期化学成分分析

对不同生长期怀山药化学成分进行分析，怀山药（品种）水溶性浸出物含量、腺苷含量在12月18日之前的6 次取样呈逐渐上升趋势，水溶性浸出物含量变化范围为（17.52±3.73）%～（19.26±0.69）%、腺苷含量变化范围为（0.027±0.001）%～（0.032±0.007）%，中间1次～2 次出现折点，含量有所降低，但是整体趋势上升，12月18日之后这些含量达到稳定状态；尿囊素含量从9月开始波动变化，到12月18日含量有所降低，从（0.97±0.20）%降至（0.85±0.11）%，随后平缓上升；山药多糖含量从9月中旬开始逐渐下降，到11月初达最低值（6.14±0.38）%，随后逐渐上升，到 12月18日达最大（13.90±2.33）%，之后达到稳定状态；果糖含量逐渐上升，波动不大，到 1月中旬达最大值（1.59±0.35）%，葡萄糖、蔗糖和麦芽糖变化趋势一致，开始逐渐升高，但是葡萄糖和麦芽糖在12月初达最大值，蔗糖在12月中旬达最大值，葡萄糖和麦芽糖最大值分别是（26.78±2.25）%，（42.10±1.21）%，蔗糖最大值是（1.78±0.13）%，随后三者均平缓下降，麦芽三糖与其他单糖寡糖变化相反，开始含量逐渐降低，到12月中旬达最小值，随后逐渐上升，如图6。

图6 不同生长期怀山药（品种）化学成分积累图Fig.6 Accumulation of chemical constituents of Huai yam in different growth period

铁棍山药各化学成分变化规律与怀山药（品种）相近，水溶性浸出物含量、腺苷含量逐渐上升，水溶性浸出物含量变化范围为（14.20±0.58）%～（15.48±1.86）%、腺苷含量变化范围为（0.024±0.002）%～（0.032±0.001）%，中间1 次～2 次出现折点，含量有所降低，但是整体趋势上升；尿囊素含量从9月开始波动变化，到12月18日含量有所降低，从（1.22±0.17）%降至（0.96±0.03）%；山药多糖含量从采样开始逐渐下降，到11月初达最低值（5.43±1.00）%，随后逐渐上升；果糖含量逐渐上升，波动不大，到12月中旬达最大值（1.06±0.08）%，葡萄糖、蔗糖和麦芽糖变化趋势一致，开始逐渐升高，在12月中旬达最大值，葡萄糖最大值为（30.74±1.63）%，蔗糖最大值是（1.70±0.94）%，麦芽糖最大值是（40.88±1.17）%，麦芽三糖与其他单糖寡糖变化相反，含量逐渐降低，到12月中旬达最小值，如图7。

图7 不同生长期铁棍山药化学成分积累图Fig.7 Accumulation of chemical constituents of Tiegun yam in different growth period

3 结论与讨论

由怀山药（品种）和铁棍山药折干率动态积累图可以得出，山药在12月以前是生长旺盛期，进行营养物质的不断积累，折干率也逐渐增大，12月以后折干率趋于平稳，表明折干率已达到最大值，怀山药（品种）和铁棍山药进入休眠期。根据产地调查情况，怀山药（品种）采挖出来之后进行产地加工，但是全部采挖出来加工不完，冬天气温过低，山药含水量大过冬易冻坏，造成损失，所以农户多在次年2月进行采挖，根据折干率变化趋势，到次年2月底，折干率有所下降，建议农户采挖时在2月底采挖完全，若3月采挖折干率会有所下降。铁棍山药在11月中旬就已达到折干率最大值，可根据化学成分积累规律进行采挖售卖。

纵观怀山药化学成分变化规律，水溶性浸出物反应了怀山药中可溶性物质的多少，较整体反应怀山药的质量[13]，怀山药（品种）和铁棍山药浸出物含量均逐渐上升，到12月中旬达最大值；山药多糖是山药主要活性成分[14]，两种怀山药在积累先下降再上升，至12月中旬达最大值；尿囊素和腺苷是怀山药中有效化学成分[15]，是植物次生代谢产物，变化较为平稳，其中尿囊素含量有所下降，腺苷呈上升趋势；怀山药中淀粉是最重要的营养物质，本试验将其水解为单糖、寡糖，进一步观察其变化规律，怀山药（品种）果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽三糖在整个生长过程中含量变化较大，整体来说在果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖在12月中旬之前呈上升趋势，之后有所下降，但是果糖、葡萄糖最终含量是增高了，而蔗糖和麦芽糖含量降低，推断在怀山药（品种）在休眠期时维持自身生长消耗了体内的糖类成分，而低聚糖蔗糖、麦芽糖、麦芽三糖降解成了果糖、葡萄糖，所以果糖、葡萄糖最终含量是上升的，麦芽三糖与其他单糖寡糖变化相反，开始呈下降趋势，到12月中旬之后有所上升，铁棍山药在12月中旬之前与怀山药（品种）变化一致。怀山药化学成分含量趋势都会有折点出现，推断是养分在积累过程中自我消耗导致降低，随后植物体又合成使含量升高，也可能是天气骤变导致化学物质合成受到影响。

综上所述，将怀山药的产量与化学成分积累规律综合考虑得出：怀山药（品种）在12月中旬折干率和化学成分都达到最大，适合采收，但是经产地调查发现，农户会等到第二年2月左右大规模采收，原因是怀山药（品种）采收出来后进行产地加工，由于怀山药（品种）产量大，并且产地加工历程时间长，如果第一年12月将其全部采收出来后，农户会加工不完，山药含水量大过冬易冻坏，造成药材损失，所以农户多在过冬后采收，但是结合折干率和化学成分积累规律，建议在次年3月前采收完毕，以免产量和有效成分含量降低；铁棍山药在11月中旬折干率就达到最大值，但是有效成分含量到12月中旬达到最大值，所以结合折干率及有效成分含量，12月中旬采挖最好。数据结论与山药传统采收时间一致，表明传统采收时间科学合理，本研究为怀山药的科学食用、合理采收、规范化种植提供了理论依据。