基于取代苯甲酰肼缩丙酮酸配体的二苄基锡配合物的合成、晶体结构及生物活性

罗 波 余浩田 刘梦琴 张复兴 邝代治 谭宇星 蒋伍玖

(衡阳师范学院化学与材料科学学院，功能金属有机材料湖南省普通高等学校重点实验室，功能金属有机化合物湖南省重点实验室，衡阳421008)

0 引 言

癌症的死亡率仅次于心脑血管疾病，严重威胁着人类的生命健康。目前，外科手术、放射性疗法和化学疗法是现代医学中用来治疗癌症的3种主要手段，前两者主要用于治疗良性非转移的肿瘤，后者主要针对晚期恶性、顽固性的肿瘤。因此，新型抗肿瘤药物的研发对癌症的治疗具有重大意义。20世纪60年代末，顺铂（Ⅱ）抗癌作用的发现及临床应用，开辟了金属配合物抗癌药物研究的新领域[1]。随着人们对金属配合物药理作用认识的进一步深入，许多新型的具有抗癌活性的金属配合物不断被合成出来[2-4]。自1980年Crowe[5]首次报道二烃基锡化合物具有抑制癌细胞增殖作用以来，二烃基锡化合物在抗癌药物领域受到了人们的广泛关注。与其它结构类型的有机锡化合物相比，二烃基锡化合物通常具有更好的抗癌活性[6-8]；但是常规二烃基锡化合物的生物兼容性差，脂水分配系数大，严重制约了其药物应用。因此，利用具有良好生物兼容性的配体同二烃基锡反应制备新型有机锡配合物并研究其抗癌活性，这一工作就显得更加重要。酰腙类化合物由于其良好的生物兼容性及复杂多变的配位模式，近年来得到了广泛关注[9-12]。结合前期研究，本文拟考察不同电子类型取代基调控对苄基锡抗肿瘤活性的影响。我们选取苯环对位具有不同电子类型取代基的酰肼与丙酮酸缩合产物作为配体，合成了2个二苄基锡配合物，初步研究了配合物对癌细胞的体外抑制活性，并通过荧光光谱及凝胶电泳法研究了配合物与DNA的作用情况。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

IR用日本岛津Prestige-21红外光谱仪(4 000～400 cm-1，KBr压片) 测定；1H、13C 和119Sn NMR 用Bruker AVANCE-500核磁共振仪测定；元素分析用PE-2400（Ⅱ）元素分析仪测定；晶体结构用Bruker SMART APEXⅡCCD单晶衍射仪测定；HRMS用Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL(ESI源)测定；荧光光谱用日本日立F-7000荧光光谱仪测定；凝胶电泳用北京六一仪器厂DYY-6C型电泳仪测定；热重用德国NETZSCH TG 209 F3热重分析仪；熔点用北京泰克X-4双目体视显微熔点测定仪测定 (温度计未经校正)。取代苯甲酰肼缩丙酮酸配体和二苄基二氯化锡参考文献[13-14]方法合成。溴化乙锭(EB)、小牛胸腺DNA、三羟甲基氨基甲烷(Tris)为Sigma-Aldrich公司产品，质粒pBR322 DNA定制于上海生工生物工程公司。其它试剂均为分析纯，溶剂参考文献[15]方法纯化，水为超纯水。Tris-HCl(0.01 mol·L-1)缓冲溶液通过称取一定量Tris用0.1 mol·L-1的盐酸溶液调至pH值为7.40，使用前配制。小牛胸腺DNA的纯度通过比较260和280 nm处的吸光度来确定(A260/A280=1.8～1.9)，用所需pH值条件下缓冲溶液配制，浓度通过测定260 nm处的吸光度计算而得(ε260=6 600 L·mol-1·cm-1)，其储备液置于4℃保存；溴化乙锭溶液通过称取适量溴化乙锭固体，用pH=7.40的Tris-HCl(0.01 mol·L-1)缓冲溶液配制。

1.2 配合物的合成

于50 mL圆底烧瓶中，加入1 mmol对甲氧基苯甲酰肼缩丙酮酸或对硝基苯甲酰肼缩丙酮酸，1 mmol二苄基二氯化锡，25 mL甲醇，搅拌回流6 h。冷却，过滤，旋转蒸除溶剂，用甲醇重结晶，得淡黄色晶体C1或C2。

配合物C1：产率78.3%。m.p.189～191℃。元素分析(C26H28N2O5Sn)实测值(括号内为计算值，%)：C，55.11(55.05)；H，4.93(4.98)；N，4.92(4.94)。 IR(KBr，cm-1)：3 419，3 078，3 020，2 935，2 835，1 633，1 602，1 581，1 490，1 390，1 334，1 251，1 172，1 211，1 082，1 029，921，842，758，696，638，624，590，551，514，459。1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ7.98(d，J=9.0 Hz，2H)，6.893～7.01(m，12H)，3.90(s，3H)，3.25(s，4H)，2.04(s，3H)。13C NMR(125 MHz，CDCl3)：δ174.49，168.33，162.89，151.13，136.41，130.73，128.31，128.24，125.40，125.34，113.50，55.43，50.85，34.30，12.77。119Sn NMR(Me4Sn，187 MHz，CDCl3)：δ-606.55。 HRMS(ESI)m/z按 C25H25N2O4Sn+[M-CH3OH+H]+计算值:537.083 08，实测值:537.082 46。

配合物 C2：产率 74.6%。 m.p.118～120℃(dec)。元素分析 (C25H25N3O6Sn)：实测值 (括号内为计算值，%)：C，51.59(51.58)； H，4.37(4.33)；N，7.21(7.22)。IR(KBr，cm-1)：3 404，3 080，3 057，3 024，2 937，1 678，1 620，1 598，1 529，1 492，1 452，1 384，1 338，1 292，1 205，1 157，1 105，1 068，1 014，921，858，759，719，696，592，553，536，459。1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ8.29(d，J=8.4 Hz，2H)，8.21(s，1H)，8.13(d，J=8.8 Hz，2H)，6.94～6.99(m，9H)，3.33(s，4H)，2.07(s，3H)。13C NMR(125 MHz，CDCl3)：δ172.58，162.19，149.90，138.66，129.59，128.98，128.61，128.39，128.16，125.70，123.36，50.90，40.84，13.05。119Sn NMR(Me4Sn，187 MHz，CDCl3)：δ-634.61。 HRMS(ESI)m/z按 C24H22N3O5Sn+[M-CH3OH+H]+计算值：552.057 59，实测值：552.057 50。

图1 配合物的合成线路图Fig.1 Synthetic routes of the complexes

1.3 晶体结构测定

选取尺寸为 0.26 mm×0.24 mm×0.23 mm(C1)和0.22 mm×0.20 mm×0.18 mm(C2)的配合物晶体，在Bruker SMART APEXⅡCCD单晶衍射仪上，采用经石墨单色化的 Mo Kα 射线(λ=0.071 073 nm)，以φ～ω扫描方式收集衍射数据。全部数据经Lp因子和多重扫描吸收校正。晶体结构由直接法解出，部分非氢原子坐标在随后的差值Fourier合成中陆续确定，理论加氢法给出氢原子在晶胞中的位置坐标。对非氢原子坐标及其各向异性热参数和氢原子坐标及其各向同性热参数进行全矩阵最小二乘法修正至收敛，全部结构分析计算工作采用SHELX-97程序系统完成[16]。

CCDC：1895352，C1；1895353，C2。

表1 配合物的晶体学数据Table 1 Crystallographic data of the complexes

续表1

1.4 体外抗癌活性测定

将待测药物溶于少量DMSO，用水稀释至所需浓度，保持最终DMSO浓度小于0.1%。MCF7、HepG2、H460细胞株取自美国组织培养库(ATCC)，MCF7、HepG2、H460细胞株用含 10%胎牛血清的RPMI 1640(GIBICO公司)培养基，在5%(体积分数)CO2、37℃饱和湿度培养箱内进行体外培养。体外抗癌药敏试验是通过MTT法测定。数据处理使用Graph Pad Prism version 7.0程序，化合物IC50通过程序中具有S形剂量响应的非线性回归模型进行拟合得到。

1.5 配合物与DNA-EB作用的荧光光谱法研究

在5 mL容量瓶中分别加入小牛胸腺DNA、EB及不同浓度的配合物溶液，混匀，25℃下放置3.5 h，分别扫描荧光光谱，激发波长为258 nm，发射波长见图谱，激发和发射光谱扫描狭缝宽度均为5.0 nm。

1.6 配合物与质粒p BR322 DNA作用的凝胶电泳法研究

在凝胶电泳实验中，使用TAE(pH=8.0)缓冲液和1%琼脂糖制备凝胶，用Goldview染色。将不同浓度配合物溶液与质粒pBR322 DNA(0.5μg·μL-1)混合均匀，并在25℃孵育1 h，然后将其加入凝胶中，在150 V的电泳槽中电泳45 min，电泳结束后在UV光下进行拍照。

2 结果与讨论

2.1 谱学研究

在配合物C1和C2的红外谱图中，C1和C2配位键的特征峰 ν(Sn-O)、ν(Sn-O-Sn)、ν(Sn-N)和 ν(Sn-C) 分别位于 590、551、514、459 cm-1和 592、553、536、459 cm-1处，与文献[17-20]报道的类似化合物的出峰位置一致，由此表明有机锡配合物的形成。

在1H NMR谱中，其各组峰的积分面积之比与预期结构的各组质子数相对吻合[21]；从谱图中可以看到，配合物C1和C2中芳环上氢质子的出峰位置分别在7.01～7.98和6.99～8.29；苄基上亚甲基氢质子分别在3.25和3.33出峰，N-(2-丙酸)-芳甲酰腙配体上甲基氢质子分别出峰在2.04和2.07，2个配合物的氢质子出峰基本保持一致，说明2个配合物具有相似的不对称结构单元。在13C NMR谱中，其各组峰与理论推测结构碳原子数相吻合[21]，与X射线单晶衍射结果一致。在119Sn NMR谱中，C1和C2分别在-606.55和-634.61处呈现一个单峰，表明2个配合物中均仅存在一种单一的有机锡化合物。

2.2 晶体结构

配合物C1、C2的主要键长和键角数据列于表2，分子结构见图2、3。在配合物C1中，配合物C1的不对称结构单元通过Sn-Oi键作用构成一维螺旋链状结构，如图4所示，其Sn-Oi键键长为0.261 58(18)nm，虽大于Sn-Oi共价键长，但是小于锡原子与氧原子范氏半径之和，且比文献报道[22-23]相似配合物的Sn-Oi略短，说明配合物C1的一维螺旋链状结构是由较强的Sn-Oi键作用构成。链中的每1个螺旋由 2个[p-MeO-C6H3(O)C=N-N=C(Me)COO](CH3OH)(C6H5CH2)2Sn单元组成，其长度为0.928 38(27)nm，并且相邻的锡原子之间的距离为0.606 06(4)nm，夹角为 99.997(4)°。

配合物C1的中心锡原子Sn1与来自配体中的2个氧原子O1和O2，1个亚氨基氮原子N2，1个配位甲醇氧原子O5，来自2个对甲基苄基中的亚甲基碳原子C12和C19以及来自另1个配体分子中的O3i等配位，形成七配位五角双锥构型。 O1、O2、O5、N2、O3i占据了赤道平面的5个位置，2个亚甲基碳原子C12和C19则占据了该平面两侧的轴向位置，轴向 C12-Sn1-C19 键角为 158.85(10)°，与 180°偏离了21.15°，且赤道平面的5个原子与中心锡原子的键长不等(dSn1-O1=0.218 20(16)nm；dSn1-O2=0.226 86(17)nm；dSn1-O5=0.252 5(2)nm；dSn1-N2=0.224 65(19)nm；dSn1-O3i=0.261 58(18)nm)，其差值为 0.002 21～0.043 38 nm，且键角也不相等(∠O1-Sn1-O5 74.24(7)°；∠O1-Sn1-N2 70.03(7)°；∠N2-Sn1-O2 69.95(6)°；∠O2-Sn1-O3i70.486(56)°；∠O5-Sn1-O3i75.413(64)°)，因此，该配合物中心锡原子为七配位畸变五角双锥构型。

表2 配合物的部分键长和键角Table 2 Selected bond lengths(nm)and bond angles(°)of the complexes

图2 配合物C1的分子结构图Fig.2 Molecular structure of complex C1

图3 配合物C2的分子结构图Fig.3 Molecular structure of complex C2

图4 配合物C1一维螺旋链状结构Fig.4 One dimensional infinite helical chain structure of C1

配合物C2为双锡核分子，分子中心存在1个Sn2O2平面中心四元环，环的中心就是分子的对称中心，四元环由羧基氧原子以μ3-桥联配位Sn原子，且与2个锡原子的键长不等，其中dSn1-O2=0.231 14(16)nm，属于正常Sn-O共价键长；而dSn1-O2i=0.276 50(15)nm，虽小于锡原子与氧原子范氏半径之和，但是大于配合物C1中的Sn-Oi键键长，说明该Sn-Oi键的作用比配合物C1中的弱。与配合物C1相似，配合物C2的中心锡原子Sn1也是形成七配位五角双锥构型。轴向 C11-Sn1-C18键角为 165.49(11)°，与 180°偏离了14.51°，比配合物C1的偏离程度小，在配合物C2中，赤道平面的5个原子与中心锡原子的键长也均不相等，因此，配合物C2中心锡原子也为七配位畸变五角双锥构型。

2.3 热稳定性研究

为了研究配合物的热稳定性，采用NETZSCH TG 209 F3热重分析仪，在空气氛下，加热速度为20℃·min-1，气体流速为 20 mL·min-1，在 40～800 ℃范围内对配合物进行热重测试。如图5、6所示，随温度的升高，配合物发生相似的失重过程。在初始阶段40～180 ℃，配合物 C1 失重为 5.54%(理论值:5.64%)，C2为5.22%(理论值：5.50%)，分别对应配合物失去配位的甲醇分子；配合物C1、C2的中间失重阶段均相对模糊，在170～800℃范围内失重，对应配合物分子失去取代苯甲酰肼缩丙酮酸配体及苄基，最终稳定在约26.43%(C1)和26.58%(C2)，残余物与SnO2的计算含量26.57%(C1)及25.89%(C2)吻合；上述热分析结果表明配合物C1、C2分别在90、118℃之前可稳定存在。

图5 配合物C1的热重分析Fig.5 Thermogravimetric analysis curve of complex C1

图6 配合物C2的热重分析Fig.6 Thermogravimetric analysis curve of complex C2

2.4 体外抗癌活性研究

表3列出了配合物C1、C2和卡铂对体外培养癌细胞NCI-H460(人肺癌细胞)、HepG2(人肝癌细胞)、MCF7(人乳腺癌细胞)的抑制活性。从表中数据可知，配合物C1、C2对3种癌细胞都有一定的抑制作用，配合物C1对NCI-H460最为敏感，其IC50=(4.66±0.27)μmol·L-1。 在 HepG2 和 MCF7 两种癌细胞中，C1、C2的抑制活性相当；在NCI-H460癌细胞中，C1的体外抑制活性优于卡铂，C2略低于卡铂。结合配合物结构进行构效分析可以发现：配合物C1、C2晶体结构类型虽然不同，但其在溶液中的存在结构相似(高分辨质谱及核磁共振结果表明其在溶液中均可以单分子形式存在)，说明配体酰肼苯环对位不同电子类型的取代基对配合物的抗癌活性影响较小。由此推测，配体酰肼苯环对位取代基可能不是有效药效基团；另一方面，二苄基锡配合物具一定的抗癌活性，这可能和配体与有机锡的协同作用有关[24-25]。

2.5 配合物与DNA-EB作用的荧光光谱研究

图7为不同浓度的配合物C1对EB-DNA复合体系的荧光淬灭曲线。加入配合物C1，DNA-EB体系的荧光明显降低，说明配合物C1的存在使DNAEB体系的荧光产生了猝灭[26]。为了较为定量地研究配合物与DNA的结合能力，根据经典Stern-Volmer方程[27-28]：I0/I=1+KSVccomplex，由曲线拟合推断其作用属于静态猝灭，计算出配合物C1与DNA作用的猝灭常数 KSV为 7.0×104L·mol-1，比文献[29-30]报道的结合常数大，其大小定量地反映出配合物与DNA插入作用的能力，通过比较结合常数可以看出配合物C1与DNA存在较强的插入作用，推测可能是配合物的中心锡原子与DNA分子中的碱基基团配位结合，配合物中的端基配体芳环插入到DNA的碱基对中，竞争了EB与DNA的结合，把EB从DNA分子的碱基对中挤出。

图7 配合物C1与EB-DNA体系相互作用的荧光光谱图Fig.7 Effect of complex C1 on the fluorescent spectra of EB-DNA system

表3 配合物对癌细胞的体外抑制活性Table 3 Inhibition action of the complexes to cancer cell in Vitro

2.6 配合物与质粒p BR322 DNA作用的凝胶电泳法研究

通过凝胶电泳法研究了不同浓度的配合物C1切割超螺旋pBR322 DNA的能力，结果如图8所示。从图8可以看出，配合物C1可以有效地切割双链DNA，并且其切割活性与配合物浓度有关。当配合物浓度逐渐增加时，可观察到FormⅠ逐渐减少，而FormⅡ逐渐增加。DNA的双螺旋结构慢慢解体为缺刻开环型[31-32]，并且随着配合物浓度的增加，切割效果更加明显。但是，当浓度达到120μmol·L-1时，仍然没有出现线性(FormⅢ)。因此，配合物C1对DNA的切割活性结果表明，配合物C1能有效地将超螺旋DNA切割成缺刻型DNA。

图8 配合物C1切割质粒DNA pBR322的凝胶电泳图Fig.8 Agarose gel electrophoresis of pBR322 treated with different concentrations of C1

3 结 论

二苄基二氯化锡分别与对甲氧基苯甲酰肼缩丙酮酸及对硝基苯甲酰肼缩丙酮酸反应，合成了2个苄基锡配合物(C1、C2)。结构分析表明，C1通过Sn-O键构成一维无限螺旋链状结构，C2为双锡核分子，以Sn2O2四元环为中心对称，2个配合物的中心锡原子与配位原子均形成七配位畸变五角双锥构型。热分析结果表明，在空气氛下，配合物C1在90℃、C2在118℃以下可稳定存在。抗癌活性结果表明C1、C2对HepG2和MCF7两种癌细胞的抑制作用无明显区别，仅对于NCI-H460癌细胞，配合物C1优于配合物C2。在Tris-HCl缓冲溶液中，以EB作为荧光探针，用荧光光谱法初步研究了配合物C1与小牛胸腺DNA的相互作用，配合物C1与小牛胸腺DNA作用是插入结合作用所致；并且用凝胶电泳法研究了配合物C1切割质粒DNA pBR322的能力，结果表明配合物C1能有效地将超螺旋DNA pBR322切割成缺刻型DNA。

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