survivin和Ki-67蛋白在喉癌患者中的表达情况及与临床特征的关系

张晓静，贺松坡，曹银生

许昌市中心医院耳鼻喉科，河南 许昌4610000

喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一，占头颈部恶性肿瘤的3.3%～8.1%，以鳞状细胞癌最常见[1]。目前喉癌的发生尚无确切病因，可能是多种因素共同作用导致，例如吸烟、空气污染、职业因素以及病毒感染等[2]。喉癌的发生与多种癌基因和抑癌基因的表达、调控以及细胞凋亡有关[3]。研究发现，存活蛋白（survivin）、Ki-67在肿瘤的发生和转移中具有一定作用[4]。目前有关survivin、Ki-67在喉癌中作用机制的研究较少。本研究探讨了survivin和Ki-67蛋白在喉癌患者中的表达情况及其与临床特征的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2015年3月至2017年4月许昌市中心医院收治的喉癌患者的临床资料。纳入标准：①术前未合并其他部位恶性肿瘤；②术后经病理证实为喉癌；③均接受根治性切除手术；④术后生存期＞1个月，且未发生围手术期并发症；⑤具有术后病理组织标本[喉癌组织和（或）癌旁组织]；⑥术前未接受放化疗；⑦无高血压、糖尿病、肾炎、急慢性盆腔炎及子宫内膜异位症等疾病，均未服用影响前列腺素和血栓素代谢的药物。排除标准：①合并其他系统严重疾病者；②合并贫血及凝血功能障碍者；③合并风湿及免疫系统疾病者；④合并严重的肝肾功能疾病者；⑤合并甲状腺功能障碍者。根据纳入和排除标准，本研究共纳入120例喉癌患者。收集喉癌组织标本120例及癌旁组织标本50例，癌旁组织均经病理证实为炎症或正常黏膜。采集到喉癌组织的120例患者中，男68例，女52例；年龄32～73岁，平均年龄为（55.1±12.9）岁；分化程度：高分化58例，中低分化62例；有淋巴结转移61例，无淋巴结转移59例；TNM分期：Ⅰ期33例，Ⅱ期31例，Ⅲ期26例，Ⅳ期30例；采集到癌旁组织的50例患者中，男28例，女22例；年龄33～70岁，平均年龄（54.4±11.5）岁。两组的年龄、性别比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 免疫组织化学染色方法

采用免疫组织化学染色法检测标本中survivin和Ki-67蛋白的表达情况。将切片脱蜡、水化处理，采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）法进行染色，使用3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，室温放置15 min。3%牛血清白蛋白封闭1 h，滴加1∶100兔抗人survivin多克隆抗体（购自美国SantaCruz公司）和鼠抗人Ki-67单克隆抗体（购自北京中山生物技术有限公司），4℃过夜。磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗3次后，滴加生物素标记的驴抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）工作液（购自武汉艾美捷科技有限公司），室温孵育1 h，PBS冲洗3次，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，孵育1 h。二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色处理，自来水冲洗，苏木素复染。切片经过梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。脱色后显微镜下观察处理。阴性对照应用PBS代替一抗进行染色，其他操作步骤相同。

1.3 免疫组织化学染色结果判定

survivin阳性颗粒呈棕色，主要定位于细胞质与细胞核；Ki-67阳性颗粒呈浅黄色或棕黄褐色，主要定位于细胞核。每张切片随机选取10个高倍镜（400倍）视野，每个视野计数100个细胞，对染色强度和阳性细胞比例进行评分[5]。染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞比例评分：＜25%为0分，25%～50%为1分，51%～75%为2分，＞75%为3分。将染色强度评分与阳性细胞比例评分相加，0分为阴性（-），1～2分为弱阳性（+），3～4分为中等阳性（++），5～6分为强阳性（+++）。所有病理切片均由两位高年资病理医师采用双盲法进行评定。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 survivin和Ki-67蛋白表达情况的比较

喉癌组织中survivin和Ki-67蛋白的阳性表达率分别为61.67%（74/120）和65.83%（79/120），分别明显高于癌旁组织的14.00%（7/50）和16.00%（8/50），差异均有统计学意义（χ2=32.148、35.079，P＜0.01）。（表1、表2、图1）

表1 喉癌组织和癌旁组织中survivin蛋白的表达情况

表2 喉癌组织和癌旁组织中Ki-67蛋白的表达情况

图1 survivin和Ki-67蛋白在喉癌组织和癌旁组织中的表达情况（免疫组织化学染色，×200）

2.2 不同临床特征的喉癌患者喉癌组织中survivin和Ki-67蛋白表达情况的比较

不同年龄、性别、分化程度的喉癌患者喉癌组织中survivin和Ki-67蛋白的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的喉癌患者喉癌组织中survivin蛋白的阳性表达率均明显高于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（χ2=7.897、7.689，P＜0.01）；TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的喉癌患者喉癌组织中Ki-67蛋白的阳性表达率均明显高于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（χ2=12.417、11.588，P＜0.01）。（表3）

表3 不同临床特征的喉癌患者喉癌组织中survivin和Ki-67蛋白的阳性表达情况（n=120）

3 讨论

喉癌的主要病理类型是喉鳞状细胞癌。近年来随着环境的变化，喉癌在中国的发病率呈上升趋势，且男性发病率远高于女性[6]。随着喉癌手术治疗和基因治疗等技术的不断进步，以及诊断和治疗水平的不断提高，中晚期喉癌的疗效获得提高，但患者的5年生存率仍不高[7]。寻找有效、特异的标志物对于喉癌的诊断和治疗具有重大意义。目前喉癌的发病机制尚不明确，其发生、发展可能是多基因损伤、多级因子相互作用的复杂过程，研究喉癌相关基因是揭示其发生、发展机制的重要基础。肿瘤的发生不仅与细胞增殖有关，而且与细胞凋亡有关。化疗诱发细胞凋亡的机制与凋亡调节密切相关。许多化疗药物通过活化白细胞介素-1β转化酶（interleukin-1β-converting enzyme，ICE）或相关蛋白酶而引发细胞凋亡[8]。探索抑癌基因的作用机制有助于实现对肿瘤的靶向治疗。

survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员，具有肿瘤特异性，表达于肿瘤和胚胎组织。survivin与肿瘤细胞的分化、增殖、浸润及转移密切相关[9]。survivin是目前发现的最强的凋亡抑制蛋白，关于survivin抑制细胞凋亡的机制尚未完全阐明。研究表明，survivin的作用机制可能与其扰乱了正常的细胞周期有关[10]。survivin在正常组织中几乎不表达，但在包括喉癌等多种肿瘤组织中高表达。金爱红等[11]研究发现，survivin在卵巢癌组织中表达上调。胡慈浩等[5]研究证实，survivin在喉癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织及正常喉黏膜组织。本研究结果显示，survivin在喉癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织（P＜0.01），与胡慈浩等[5]的研究结果一致，证实了喉癌的发生与survivin表达有关。

Ki-67是位于细胞核内的一种非组蛋白，其表达与细胞分裂周期密切相关。Ki-67在细胞分裂的G1、S、G2和M期均表达，然而当M期结束后，Ki-67就会很快降解。根据此特性，可以应用相应的抗体将细胞染色，从而判断肿瘤细胞的活跃程度。Ki-67蛋白是反映细胞增殖程度的重要指标。Ki-67与多种肿瘤的发生、发展和预后密切相关，广泛应用于肿瘤检测领域[12]。研究显示，Ki-67在喉癌中的表达明显升高[13]。本研究结果显示，Ki-67在喉癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织（P＜0.01），与王菊香等[14]的研究结果一致。

肿瘤细胞的分化程度越低，其增殖活性越高，因此肿瘤细胞的多少与其分化程度密切相关。然而，survivin和Ki-67蛋白在喉癌侵袭和转移中的作用机制尚不清楚。本研究分析survivin和Ki-67蛋白表达与喉癌患者临床特征的关系，结果显示，TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的喉癌患者喉癌组织中survivin和Ki-67蛋白的阳性表达率均明显高于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期和无淋巴结转移的患者（P＜0.01），表明survivin和Ki-67蛋白表达与淋巴结转移、TNM分期密切相关，说明survivin和Ki-67蛋白在喉癌的侵袭和转移中起到了重要的促进作用。

综上所述，survivin和Ki-67蛋白在喉癌组织中高表达，并且与淋巴结转移、TNM分期关系密切。因此，深入研究survivin和Ki-67蛋白在喉癌细胞侵袭和转移中的作用机制，对于探索有效的肿瘤诊治靶点、改善患者预后具有重要意义。