局部晚期乳腺癌患者新辅助化疗前后 p53、Ki-67、NM23、EGFR的表达变化及临床意义△

石国建，顾蓓，郭斌，荣鸣，张洁，于桑桑

昆山市第二人民医院甲乳外科，江苏 昆山2153000

乳腺癌属于临床常见的恶性肿瘤，目前临床常采用新辅助化疗治疗局部晚期乳腺癌，效果较好，可明显提高患者的远期生存率[1]。目前临床主要通过影像学检查评估新辅助化疗的治疗效果，但费用昂贵，加重了患者的经济负担，因此寻找预测局部乳腺癌新辅助化疗疗效的生物学指标对预后评估十分重要。研究显示，Ki-67、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）及抑癌基因p53和NM23的表达情况与乳腺癌患者的预后有关，但其与新辅助化疗的疗效是否有关目前尚不明确[2-4]。本研究通过免疫组织化学法检测局部晚期乳腺癌患者新辅助化疗前后p53、Ki-67、NM23、EGFR的表达水平，旨在探讨其与患者疗效及预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2014年11月至2015年5月昆山市第二人民医院收治的局部晚期乳腺癌患者的临床资料。纳入标准：①经病理学检查证实为乳腺癌；②临床分期为Ⅱ～Ⅲ期，符合美国国家综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）诊断标准[5]；③接受新辅助化疗。排除标准：①合并其他肿瘤；②合并肺、肝、胆、肾等重要器官受损；③临床资料不完整。根据纳入和排除标准，本研究共纳入112例乳腺癌患者。112例患者的年龄为27～68岁，平均（43.68±6.29）岁；肿瘤直径为1.32～7.66 cm，平均（3.89±0.47）cm；TNM分期：ⅡA期36例，ⅡB期28例，ⅢA期25例，ⅢB期23例。

1.2 化疗方案

新辅助化疗方案主要包括氟尿嘧啶+表柔比星+环磷酰胺序贯多西他赛（FEC-T）方案和多西他赛+表柔比星+环磷酰胺（TEC）方案。FEC-T方案：静脉滴注500 mg/m2氟尿嘧啶，第1天；静脉滴注90 mg/m2表柔比星，第1天；静脉滴注500 mg/m2环磷酰胺，第1天；21天为1个周期。3个周期后给予100 mg/m2多西他赛，第1天，21天为1个周期。TEC方案：静脉滴注75 mg/m2多西他赛，第1天；静脉滴注90 mg/m2表柔比星，第1天；静脉滴注500 mg/m2环磷酰胺，第1天；21天为1个周期。治疗3个周期后评定疗效。

1.3 疗效评价标准

依据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）制定的实体瘤疗效评价标准[6]对患者进行疗效评价：完全缓解（complete response，CR），所有病灶均消失，至少维持4周；部分缓解（partial response，PR），病灶最大直径及最大垂直直径的乘积减少50%以上，至少维持4周；疾病稳定（stable disease，SD），病灶最大直径及最大垂直直径的乘积缩小不超过50%或增加不超过25%，至少维持4周；疾病进展（progressive disease，PD），病灶最大直径及最大垂直直径的乘积增加超过25%，或出现新病灶。CR+PR为有效，SD+PD为无效。总有效率=（CR+PR）例数/总例数×100%。

1.4 免疫组织化学染色法

所有患者均进行空芯针活检穿刺获得病理标本，经4%甲醛固定后制备石蜡组织切片（4 μm），置于二甲苯中脱蜡，梯度乙醇脱水。将切片置于柠檬酸钠溶液中孵育20 min，3%过氧化氢中孵育10 min，10%正常山羊血清中孵育30 min，添加前B细胞白血病同源盒基因3（pre-B-cell leukemia transcription factor 3，PBX3）一抗，4℃孵育过夜，添加生物素化的二抗，孵育30 min，随后添加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，孵育15 min。磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤后，添加100 μl二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）溶液，显微镜下观察直至显色，水洗后添加苏木精进行复染，氨水返蓝后用自来水冲洗。最后，将切片在乙醇中脱水，并在二甲苯中透明。

1.5 评分标准

p53、Ki-67均定位于细胞核，NM23定位于细胞质，EGFR定位于细胞质与细胞膜。由2名资深病理科医师以半定量法[7]进行评分。阳性细胞所占百分比评分：＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。染色强度评分：无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。最终得分为阳性细胞所占百分比评分和染色强度评分乘积，≥6分为阳性，＜6分为阴性。

1.6 随访方法

所有患者均随访3年，主要采用电话、复诊、信件联系的方式进行随访，记录患者从开始治疗到死亡的时间。

1.7 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差±s）表示；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用Logistic回归分析进行多因素分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 化疗前后p53、Ki-67、NM23、EGFR阳性表达情况的比较

化疗后乳腺癌患者p53、Ki-67、EGFR的阳性表达率均低于化疗前，NM23阳性表达率高于化疗前，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 112例乳腺癌患者化疗前后 p53、Ki-67、NM23、EGFR阳性表达情况的比较[ n（%）]

2.2 化疗前 p53、Ki-67、NM23、EGFR表达情况与化疗疗效的关系

化疗后，PR患者12例，CR患者63例，SD患者33例，PD患者4例。有效患者75例，无效患者37例，总有效率为66.96%（75/112）。化疗前p53、Ki-67、EGFR阴性患者的化疗有效率高于p53、Ki-67、EGFR阳性患者，而NM23阴性患者的化疗有效率低于NM23阳性患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

表2 化疗前 p53、Ki-67、NM23、EGFR表达情况与乳腺癌患者化疗疗效的关系（n=112）

2.3 不同临床特征乳腺癌患者化疗疗效的比较

不同年龄、病理类型、临床分期、肿瘤直径、淋巴结转移情况的乳腺癌患者的化疗疗效比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。不同组织学分级的乳腺癌患者的化疗疗效比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。（表3）

2.4 乳腺癌患者化疗疗效影响因素的多因素分析

以化疗前p53、Ki-67、NM23、EGFR表达情况和组织学分级为自变量，患者化疗是否有效为因变量进行Logistic多因素回归分析，结果显示，组织学分级为Ⅲ级及p53、Ki-67、EGFR阳性表达是影响乳腺癌患者化疗疗效的危险因素，NM23阳性表达是影响患者化疗疗效的保护因素（P＜0.05）。（表4）

表3 不同临床特征乳腺癌患者化疗疗效的比较（n=112）

表4 112例乳腺癌患者化疗疗效影响因素的Logistic多因素回归分析

2.5 化疗前p53、Ki-67、NM23、EGFR表达情况与预后的关系

随访3年，无失访者，39例患者死亡，生存率为65.18%（73/112）。化疗前p53、Ki-67、EGFR阳性患者的3年生存率均低于p53、Ki-67、EGFR阴性患者，NM23阳性患者的3年生存率高于NM23阴性患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表5）

表5 化疗前 p53、Ki-67、NM23、EGFR表达情况与乳腺癌患者预后的关系（n=112）

3 讨论

新辅助化疗在局部晚期乳腺癌治疗中应用广泛，可降低患者的临床分期，保留乳房，提高患者生存率，并可根据治疗效果指导后续治疗方案的制订。大部分乳腺癌患者进行新辅助化疗后肿瘤显著缩小，患者术后生存率提高，在治疗过程中部分生物学指标发生变化，这些生物学指标在评估患者化疗效果及预后方面具有重要的临床意义。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖类抗原153（carbohydrate antigen 153，CA153）在乳腺癌患者血清中均呈高表达,且与患者化疗及组织学分级有关[8]。李文华和张莹[9]的研究显示，新辅助化疗疗效较差的乳腺癌患者雌激素受体（estrogen receptor，ER）和孕激素受体（progestogen receptor，PR）的表达水平有升高趋势，ER和PR可作为新辅助化疗疗效的预测指标。因此，分析乳腺癌患者新辅助化疗前后生物学指标的变化，对于疗效判定、预后评估及治疗方案的调整具有十分重要的意义。

p53定位于染色体17p13.1，在肺癌、胃癌、肝癌等恶性肿瘤中，超过50%的p53基因会发生突变，因此经免疫印迹检测的p53蛋白一般为突变后的p53蛋白[10]。汪小霞等[11]报道，乳腺癌中p53的阳性表达率为40%；Liu等[12]报道，乳腺癌中p53的阳性表达率为30%。本研究结果显示，新辅助化疗后乳腺癌患者的p53阳性表达率为25.89%，低于新辅助化疗前的38.39%，差异有统计学意义（P＜0.05）。研究显示，p53与乳腺癌化疗疗效有关，是化疗疗效的独立预测因子[13]。另有研究显示，上调p53的表达能够在乳腺癌治疗中发挥较好的抗肿瘤作用[12]。本研究结果显示，化疗前p53阳性患者的有效率低于p53阴性患者（P＜0.05）。Logistic分析结果显示，p53是乳腺癌新辅助化疗患者预后的独立影响因素。生存分析显示，化疗前p53表达情况与患者的远期预后有关。

Ki-67为细胞核蛋白，与细胞分裂、增殖有关，在乳腺癌的发生发展及细胞增殖、分化、凋亡中发挥重要作用。研究显示，乳腺癌组织中Ki-67的阳性表达率明显高于良性乳腺组织，且随着肿瘤分期的升高及肿瘤直径的增加，其阳性表达率逐渐升高[14]。另有研究显示，Ki-67与乳腺癌患者新辅助化疗疗效有关，其在化疗后表达水平降低[15]。刘现义等[16]研究显示，385例乳腺癌患者接受新辅助化疗后的Ki-67阳性表达情况发生明显变化，Ki-67是影响患者预后的独立因素。本研究结果显示，新辅助化疗后乳腺癌患者的Ki-67阳性表达率低于新辅助化疗前，化疗前Ki-67阳性患者的有效率低于Ki-67阴性患者（P＜0.05）。Logistic分析结果显示，Ki-67是乳腺癌新辅助化疗患者预后的独立影响因素。生存分析显示，化疗前Ki-67表达情况与患者的远期预后有关。

NM23为肿瘤转移抑制基因，位于染色体17号长臂。研究发现，乳腺癌组织中NM23的阳性表达率明显低于良性乳腺组织，且淋巴结转移患者的NM23阳性表达率明显低于淋巴结未转移的患者，提示NM23与肿瘤转移关系密切[17]。另有研究显示，NM23与乳腺癌患者的预后有关，其表达水平降低导致对肿瘤转移的抑制能力减弱，因此患者预后较差[18]。本研究结果显示，新辅助化疗后乳腺癌患者的NM23阳性表达率高于新辅助化疗前，化疗前NM23阳性患者的有效率高于NM23阴性患者（P＜0.05）。Logistic分析结果显示，NM23是乳腺癌新辅助化疗患者预后的独立影响因素。生存分析显示，化疗前NM23表达情况与患者的远期预后有关。

EGFR定位于染色体7p11上，在调控细胞有丝分裂、细胞周期等方面发挥重要作用。EGFR能够调控肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移，已成为肿瘤治疗的靶点。李雅婷等[19]研究显示，EGFR过表达的肿瘤细胞分化程度较低，患者易出现转移，预后较差。临床研究显示，乳腺癌患者中EGFR的阳性表达率明显高于良性乳腺疾病患者，随访结果显示，复发及转移患者中EGFR的阳性表达率高于未复发及未转移的患者，提示EGFR可作为预测乳腺癌复发、转移的指标[20]。本研究结果显示，新辅助化疗后乳腺癌患者的EGFR阳性表达率低于新辅助化疗前，化疗前EGFR阳性患者的有效率低于EGFR阴性患者（P＜0.05）。Logistic分析结果显示，EGFR是乳腺癌新辅助化疗患者预后的独立影响因素。生存分析显示，化疗前EGFR表达情况与患者的远期预后有关。

综上所述，新辅助化疗后 p53、Ki-67、NM23、EGFR的阳性表达率均有变化，化疗前上述指标的表达情况与化疗后疗效及远期预后有关，可作为预测新辅助化疗疗效的指标。本研究存在一定的局限性，病例数较少，后续还需纳入更多病例，以期为乳腺癌的预防、治疗提供更有力的依据。