丹参酮分别联合伊曲康唑、特比萘芬对红色毛癣菌体外抗菌活性研究Δ

王 丹，于淑萍，吴景良，齐海花，段昕所

(1.无锡市第三人民医院整形美容科，江苏 无锡 214000； 2.承德医学院附属医院皮肤性病科，河北 承德 067000)

真菌性皮肤病是由皮肤癣菌感染，其中红色毛癣菌是常见皮肤癣菌。近年来，红色毛癣菌病的发病率逐年升高，因其治愈效果较差，病死率也呈不断升高趋势；由于红色毛癣菌隐藏较为隐蔽，所致疾病的病程较长，不仅难以治愈，还容易反复发作及再感染，若未及时救治，甚至可引发丹毒、淋巴管炎及感染中毒性休克等并发症，降低患者生活质量[1]。目前，临床主要采用丹参酮、伊曲康唑及特比萘芬等抗真菌药治疗红色毛癣菌感染，但不同药物对红色毛癣菌的敏感性存在差异性。同时，因临床用药时间过长导致耐药菌株显著增加，故多应用联合治疗以减少耐药性，提高治疗效果[2-3]。基于此，本研究收集红色毛癣菌并应用丹参酮、伊曲康唑及特比萘芬进行体外药物敏感试验，观察丹参酮对红色毛癣菌超微结构的影响，以期为临床治疗提供可靠实验室依据，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

选取临床分离红色毛癣菌40株进行体外药物敏感试验，菌株来自体股癣、甲真菌病，经常规组织分离并进行形态学鉴定。男性患者17例，女性患者23例；年龄4～65岁，平均(45.32±5.94)岁；直接镜检：阳性20例，阴性20例；部位：趾甲28例，指甲8例，其他部位4例；耐35 ℃高温试验：耐高温24株，不耐高温16株；色素试验：产红色素23株，未产色素17株。

1.2 方法

参照美国临床和实验室标准化研究所(clinical and laboratory standards institute，CLSI)M38-A2方案，检测丹参酮、伊曲康唑及特比萘芬对红色毛癣菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)，并采用分级抑制浓度指数(factional inhibitory concentration index，FIC)评价丹参酮联合伊曲康唑、特比萘芬效果。

1.3 药品配制

丹参酮(美国Acros Organics公司，纯度99%)，终质量浓度为0.250 0～128.000 0 μg/ml。伊曲康唑(比利时杨森制药公司，批号：7073402)，终质量浓度为0.031 2～16.000 0 μg/ml。特比萘芬(中国药品生物制品检定所，批号：100563-200301)，终质量浓度为0.031 2～16.000 0 μg/ml。采用沙氏葡萄糖蛋白胨液体培养基倍比稀释，将其倍比稀释为由高至低8个浓度的含药培养液备用。

1.4 菌悬液的制备

红色毛癣菌于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上进行活化并纯化，并加入无菌0.85%氯化钠溶液l ml制备菌悬液，后使用巴氏吸管将菌悬液置入无菌试管中，加入1粒无菌玻璃珠在振荡器上振荡2 min，静置后取上部匀质液体再次振荡15 s。采用细胞计数板计数，用RPMI 1640液调节菌悬液浓度为(2～6)×105CFU/ml备用。再使用RPMI 1640液稀释50倍进行接种，菌悬液最终浓度为(2～6)×103CFU/ml。

1.5 试验过程

1.5.1 丹参酮、伊曲康唑及特比萘芬单独药物敏感试验：通过移液器提取丹参酮、伊曲康唑及特比萘芬的倍比稀释液100 μl，依次加入96孔板第1—10列孔，加入2倍终浓度菌悬液100 μl，第11列孔加入2倍终浓度菌悬液100 μl、RPMI 1640液体培养基100 μl作为阳性对照，第12列孔加入RPMI 1640液体培养基200 μl、不加菌悬液为阴性对照，28 ℃恒温培养，5～7 d后待阳性对照生长良好(肉眼检查出现80%以上生长抑制)进行MIC结果判定。

1.5.2 丹参酮联合伊曲康唑、特比萘芬的药物敏感试验：采用棋盘微量稀释法，使用微量移液器将药物加入96孔板第1—10列孔，按照从高到低浓度依次加入丹参酮倍比稀释药液各50 μl和伊曲康唑、特比萘芬倍比稀释液各50 μl，再加入2倍终浓度菌悬液100 μl，第11列孔加入RPMI 1640液体培养基100 μl、2倍终浓度菌悬液100 μl；第12列孔加入RPMI 1640液体培养基200 μl。28 ℃恒温培养，5～7 d后进行FIC结果判定，其中FIC<1为协同作用，1≤FIC<2为无关作用，FIC≥2为拮抗作用。

1.6 质量控制

每株菌株均重复实验3次，并进行质控、参考菌株检测，质控菌株为近平滑念珠菌ATCC 22019和克柔念珠菌ATCC6258。结果均由2名经验丰富的医师共同判读，意见不一致时可共同讨论决定。

1.7 红色毛癣菌电镜标本制备

2倍终浓度菌悬液100 μl分别由高浓度到低浓度加入96孔板第1—10列孔中，第11列孔仅加红色毛癣菌菌悬液为生长对照，第11、12列孔红色毛癣菌菌悬液与药物均不加为空白对照。将上述菌悬液100 μl分别加入各孔内，并将菌悬液与抗真菌药物(丹参酮和伊曲康唑、特比萘芬的倍比稀释液)分别以1∶1稀释至终浓度。于26 ℃环境下孵育，7 d进行常规脱水、包埋即染色等，制备成电镜样品，另选取正常红色毛癣菌作为对照，采用扫描电镜与透射电镜观察红色毛癣菌菌丝外观形态、细胞膜、细胞壁及细胞核等超微结构变化情况。

1.8 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，单独抗真菌药物的MIC比较采用多样本比较的Kruskal-wallis H检验，两两比较采用秩转换后单因素方差分析，丹参酮联合伊曲康唑、特比萘芬抗菌FIC采用精确概率法χ2检验，均以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丹参酮、伊曲康唑及特比萘芬对红色毛癣菌的MIC比较

丹参酮、伊曲康唑及特比萘芬对红色毛癣菌MIC的差异有统计学意义(P<0.05)，其中伊曲康唑MIC较低，丹参酮MIC较高，见表1。

2.2 丹参酮联合不同质量浓度伊曲康唑的FIC比较

丹参酮仅联合0.031 2、0.062 5 μg/ml的伊曲康唑时，FIC<1所占比例分别为42.50%(17/40)、45.00%(18/40)，以协同作用为主；而联合其他质量浓度的伊曲康唑时以拮抗作用为主，不同质量浓度组间比较的差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表1 丹参酮、伊曲康唑及特比萘芬对红色毛癣菌MIC结果 比较(n=40)Tab 1 Comparison of MIC results among tanshinone, itraconazole and terbinafine against trichophyton rubrum (n=40)

表2 丹参酮联合不同质量浓度伊曲康唑的FIC比较(n=40)Tab 2 Comparison of FIC results among tanshinone combined with different concentrations of itraconazole (n=40)

2.3 丹参酮联合不同质量浓度特比萘芬的FIC比较

丹参酮联合不同质量浓度的特比萘芬时均以拮抗作用为主，不同质量浓度组间比较的差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 丹参酮联合不同质量浓度特比萘芬的FIC比较(n=40)Tab 3 Comparison of FIC results among tanshinone combined with different concentrations of terbinafine (n=40)

2.4 丹参酮对红色毛癣菌扫描电镜及透射电镜结果

扫描电镜下观察，正常红色毛癣菌菌丝细胞壁完整，质地致密，细胞基质均匀，可见细胞核、线粒体等超微结构，见图1。扫描电镜下观察，250 μg/ml丹参酮作用于红色毛癣菌72 h后，菌丝形态发生明显改变，表面变粗糙，现破坏性裂缝，并出现多处断裂，见图2。扫描电镜下观察，62.5 μg/ml丹参酮作用于红色毛癣菌72 h后，菌丝形态未发生明显变化，仅见较小破坏性孔洞，且菌丝粗细均匀，见图3。透射电镜下观察，250 μg/ml丹参酮作用于红色毛癣菌72 h后，细胞变形明显，细胞壁粗糙，厚薄不均，细胞浆结构模糊，细胞核破碎，改变红色毛癣菌超微结构，见图4。

图1 正常红色毛癣菌的扫描电镜图Fig 1 Scanning electron microscopy of normal trichophyton rubrum

图2 250 μg/ml丹参酮作用于红色毛癣菌的扫描电镜图Fig 2 Scanning electron microscope of 250 μg/ml of tanshinone acts on trichophyton rubrum

图3 62.5 μg/ml丹参酮作用于红色毛癣菌的扫描电镜图Fig 3 Scanning electron microscope of 62.5 μg/ml of tanshinone acts on trichophyton rubrum

图4 250 μg/ml丹参酮作用于红色毛癣菌的透射电镜图Fig 4 Transmission electron microscopy of 250 μg/ml of tanshinone acts on trichophyton rubrum

3 讨论

临床将真菌性皮肤病分为浅部真菌病及深部真菌病，红色毛癣菌作为浅部真菌病主要致病菌，可引发手足癣、头癣及甲癣等，临床多表现为不同程度瘙痒、疼痛及功能性障碍等症状，而红色毛癣菌发病与菌株类型、免疫因素等存在密切联系[4-6]。随着临床对真菌感染研究的不断深入，抗真菌药的发展取得卓越成就，并具有良好的治疗效果，但因其广泛应用，真菌耐药现象也日益增多，引发多种不良反应，患者依从性较差[7-8]。因此，选取高效、广谱且低毒的抗真菌药成为治疗红色毛癣菌病的关键。

丹参为临床治疗常用中草药，其中丹参酮为主要有效成分之一，并包括丹参酮 Ⅰ、丹参酮 ⅡA及异丹参酮等十余种单体，具有清除氧自由基、抑制炎症细胞增殖、杀伤肿瘤细胞及抑制血管平滑肌细胞增殖等作用[9-10]。临床研究结果显示，丹参酮对铜绿假单胞菌具有较强体外抑菌作用；而对红色毛癣菌进行体外药物敏感试验发现，联合用药可发挥各种药物的不同作用机制，具有较强协同作用[11-12]。但目前关于丹参酮用于红色毛癣菌的临床研究较少，也未能明确单一用药或联合抗真菌药的效果；其中伊曲康唑、特比萘芬是治疗真菌感染常用的系统性抗真菌药，经证实两者对红色毛癣菌所致肉芽肿可发挥良好治疗作用[13-14]。故本研究探讨了丹参酮联合伊曲康唑、特比萘芬的抑菌作用，从而为临床治疗提供科学依据。

因影响MIC测定的因素较多，当前皮肤癣菌药物敏感试验标准尚未统一，本研究参照的M38-A2方案(CLSI制定)经胡小平等[15]研究结果证明其重复性及稳定性较好，可指导用药并监控耐药菌株发生。本研究结果显示，丹参酮、伊曲康唑及特比萘芬对红色毛癣菌MIC的差异有统计学意义(P<0.05)，其中伊曲康唑MIC较低，丹参酮MIC较高。表明丹参酮对红色毛癣菌的抗菌作用较弱，需联合其他有效抗真菌药提高治疗效果。丹参酮仅联合0.031 2、0.062 5 μg/ml的伊曲康唑时，FIC<1所占比例分别为42.50%(17/40)、45.00%(18/40)，以协同作用为主；而联合其他质量浓度的伊曲康唑时以拮抗作用为主，不同质量浓度组间比较的差异均有统计学意义(P<0.05)；丹参酮联合不同质量浓度的特比萘芬时均以拮抗作用为主，不同质量浓度组间比较的差异均有统计学意义(P<0.05)。提示丹参酮联合伊曲康唑、特比萘芬具有较强拮抗作用，在红色毛癣菌病治疗过程中不能在应用丹参酮同时联合伊曲康唑、特比萘芬治疗，以减少不良反应，避免抗菌药物滥用。应用电镜观察丹参酮对红色毛癣菌形态学影响，研究结果显示，250 μg/ml丹参酮对红色毛癣菌具有较强破坏性，而62.5 μg/ml丹参酮对红色毛癣菌破坏性明显降低。提示丹参酮破坏红色毛癣菌的细胞壁、细胞膜，胞内细胞器受损更为严重，增加真菌通透性，从而发挥较强抗菌作用，且不同浓度的丹参酮对红色毛癣菌作用效果存在差异性，对于其具体作用机制尚需进一步研究。

综上所述，丹参酮对红色毛癣菌具有一定抑制作用，随着浓度增加而抑菌作用增强。丹参酮分别联合伊曲康唑、特比萘芬对红色毛癣菌均以拮抗作用为主，故应避免联合应用。而丹参酮可使红色毛癣菌超微结构发生明显改变，进而发挥有效抗真菌作用。本研究为临床治疗因红色毛癣菌引起的真菌性皮肤病提供了实验室依据，但因所实施的体外药物敏感试验是在参考CLSI M38-A2方案与相关文献基础上进行的，理论性较强，难以反映机体实际情况，结果存在不足，对此应在大量样本基础上进行多中心加强验证，为临床治疗红色毛癣菌感染提供用药参考。